基于脱细胞基质组织工程血管的3D打印构建及其性能研究

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心血管疾病和血管创伤被认为是世界范围内致死率最高的疾病之一,在所有的治疗方法中,血管移植是替代或绕过故障血管段的首选,但是在实际的临床应用中,血管移植具有诸多限制,组织工程血管(Tissue engineered blood vessels,TEBV)的构建为血管移植提供了新思路。近年来3D生物打印的迅速发展使得复杂结构TEBV的构建成为了可能。本文研究了两种血管支架:以脱细胞外基质(Decellularized extracellular matrix,d ECM)作为内层,明胶(Gelatin,Gel)/海藻酸钠(Sodium alginate,SA)作为外层,构建了双层支架,模拟天然血管壁的多层结构;制备d ECM/纳米粘土(Nano clay,NC)/SA混合生物墨水作为3D打印材料,利用同轴打印技术构建了具有中空结构的管状支架。分别对两种支架的理化性能进行了检测,并验证了两种支架的生物相容性,体外构建了TEBV。本研究首先使用对猪源心脏血管(Porcine coronary arterie,PCA)和猪源主动脉进行脱细胞,经过反复冻融、十二烷基硫酸钠(Sodium dodecylsulphate,SDS)、Tirton X-100、胰酶等处理得到脱细胞猪源心脏血管(decellularized porcine coronary arterie,DPCA)和d ECM。对脱细胞前后的血管进行扫描电镜和组织学染色观察,并且对DNA、胶原、糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)三种基质成分进行了定量分析。结果证明了该方法对猪源血管脱细胞处理的有效性。进而构建了双层支架以模拟天然血管多层结构,以DPCA作为内层,在外面包覆一层Gel/SA水凝胶作为双层支架的外层,得到水凝胶包覆脱细胞血管支架。支架的宏观结构呈现白色、管状,内外层连接紧密。可见大量长梭型孔隙,外层孔径长约100-150μm,宽约50μm;内层孔径长约20μm,宽约10μm。元素分析结果表明支架中含量最多的是碳元素,其次是氧元素,随着SA含量的增加,Ca含量增加,表明SA的成功交联。傅里叶红外光谱(FTIR)检测表明了Gel的成功引入,及Ca2+与SA的成功交联。水凝胶的含量对七组支架的孔隙率、吸水率、溶胀率和拉伸性能均有影响。CCK-8检测和扫描电镜观察发现随着培养时间的增长,细胞从褶皱和纤维丝处向外迁移分布生长,状态良好。死活染色观察说明Gel相比于SA更有利于细胞的黏附生长。综合所有实验结果,3G2S-d支架的整体性能更好。为了检验dECM形态不同对于支架生物相容性的影响,制备了d ECM/Gel/SA和d ECM/NC/SA两种不同的生物墨水,通过可打印性分析选用NC含量为10%,SA含量为1.5%的三种比例的墨水进行后续打印,制备了3D打印的片状支架和同轴打印的管状支架。支架的内部可见大量孔隙,孔径尺寸为5-100μm。FTIR检测可见三种物质的特有吸收峰。三组支架具有较好的亲水性及溶血率。细胞实验结果表明三组支架均可黏附细胞,随着d ECM含量的增加,支架的生物相容性更好。对支架的形态对细胞增殖的影响进行了考察,发现同轴打印的管状支架上细胞的数目明显多于3D打印的片状支架,细胞集落面积也相对较大,说明3D打印支架由于打印孔隙较大导致对细胞的截留效果变差,即管状2d/10NC/1.5SA支架的综合性能较好。
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