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血友病A(hemophilia A,HA)是由于遗传性凝血因子Ⅷ基因缺陷,造成血浆因子Ⅷ含量不足或功能缺陷而引起的一组终身出血的凝血障碍性疾病,属X性联染色体隐性遗传性疾病。因子Ⅷ制品替代治疗已使血友病致残率与死亡率均大大降低。近年来,随着血友病综合防治措施的倡导和推广,在准确诊断和及时防治同时,十分强调对所有血友病A患者监测因替代治疗而产生的因子Ⅷ抑制物。伴因子Ⅷ抑制物的血友病A患者更易发生出血,且常规替代治疗难以奏效,严重威胁患者生命。血友病A患者接受含有因子Ⅷ制品替代治疗后可产生特异性抑制因子Ⅷ促凝活性的同种抗体。这类同种抗体有较大的异质性,一部分可通过与因子Ⅷ功能区的相互作用而抑制或灭活因子Ⅷ促凝活性,称为因子Ⅷ抑制物,临床上可通过Bethesda方法或改良的Nijmegen方法检测;而另一部分因子Ⅷ同种抗体与因子Ⅷ抗原表位结合,形成抗原抗体复合物,使因子Ⅷ过早地从循环中被清除,导致自体或输入的因子Ⅷ半衰期明显缩短,影响治疗效果,而此类抗体不能被常规方法检测到。本研究将探讨血友病A患者因子Ⅷ抑制物产生的相关因素,肿瘤坏死因子(TNF-α)及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)基因多态性与血友病A患者产生因子Ⅷ抑制物的相关性,通过自行建立的ELISA方法,检测了140例血友病A患者血浆抗因子Ⅷ同种抗体,以了解经过替代治疗的血友病A患者血浆抑制物的发生率,指导临床治疗,并分析因子Ⅷ同种抗体与因子ⅧC区的相互作用。1.血友病A患者因子Ⅷ抑制物发生的相关因素分析回顾性分析113例血友病A患者的临床资料及治疗情况。对其中85例经过因子Ⅷ替代治疗的患者进行因子Ⅷ抑制物检测,并分析因子Ⅷ抑制物发生的相关因素。重型74例,中型27例,轻型12例。本组经因子Ⅷ替代治疗的血友病A患者因子Ⅷ抑制物的发生率为28.24%,均为低滴度抑制物,均发生在中重型患者。首次使用因子Ⅷ持续时间、血友病患者严重程度、是否有大出血或手术大量使用因子Ⅷ史均与因子Ⅷ抑制物是否发生相关,有统计学意义(P< 0.05)。血友病A患者血浆抑制物发病率并不低,以低滴度抑制物为主,多发生在中、重型患者。首次使用因子Ⅷ持续时间超过5天、中重型血友病患者、有大出血或手术大量使用因子Ⅷ史均与因子Ⅷ抑制物发生相关。2.肿瘤坏死因子(TNF-α)及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)基因多态性与中国汉族血友病A患者因子Ⅷ抑制物发生的相关研究采用聚合酶链反应,限制性内切酶消化及电泳技术,对140例HA患者和108例正常对照者的TNF-α及CTLA-4基因的单碱基突变多态性进行检测,所有HA患者样本均应用改良的Nijmegen方法检测抑制物滴度。在HA患者中,TNF-α-308G/G基因型有118例(84.3%),G/A基因型有18例(12.8%),A/A基因型有4例(2.9%);在正常对照者中,G/G基因型有92例(85.2%),G/A基因型有11例(10.2%),A/A基因型有5例(4.6%)。TNF-α-308基因型频率在HA病例组与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。在HA患者中,C/C基因型有108例(77.2%),C/T基因型有30例(21.4%),T/T基因型有2例(1.4%);在正常对照者中, C/C基因型有81例(75%),C/T基因型有25例(23.1%),T/T基因型有2例(1.9%)。CTLA-4基因型频率在HA病例组与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。改良的Nijmegen方法检测抑制物滴度结果显示,34例(24.3%)HA患者抑制物阳性,均为低滴度抑制物。关联分析显示A等位基因携带HA患者发生因子Ⅷ抑制物的风险是非A等位基因携带患者的7.519倍(OR=7.519,95%CI=3.168～17.844);A等位基因携带重型HA患者发生因子Ⅷ抑制物的风险是非A等位基因携带重型患者的8.163倍(OR=8.163,95%CI=2.521～26.434)。TNF-α-308基因多态性与中国汉族人群重型HA患者发生因子Ⅷ抑制物具有相关性,该基因可能为HA患者替代治疗产生抑制物的调节基因之一。3.血友病A患者血浆抗因子Ⅷ同种抗体ELISA检测方法的建立及因子Ⅷ同种抗体与因子ⅧC区的相互作用血友病A患者样本140例,其中重型84例,中型34例,轻型22例;正常对照样本80例。以本室制备的抗因子Ⅷ单克隆抗体包被酶标板,4℃湿盒过夜;经3%BSA-TBS封闭后,加入重组人凝血因子Ⅷ,室温2小时;待测血浆样本经稀释后每孔加入100ul,室温2小时;充分洗涤后,加入稀释的HRP标记的羊抗人IgG,室温2小时;OPD显色,记录A490。以正常人血浆为对照,样本A490大于正常人对照3 SD定义为因子Ⅷ抗体阳性。所有患者血浆样本应用改良的Nijmegen方法检测抑制物活性。通过ELISA法检测结果显示,56例(40%)抗体阳性;改良的Nijmegen方法检测抑制物活性结果显示,34例(24.3%)抑制物阳性,均为低滴度抑制物。其中,25例通过ELISA法检测出同种抗体阳性的患者未被检出抑制物活性。为了研究抗因子Ⅷ同种抗体与因子Ⅷ的C区的相互作用,以抗His抗体包被酶标板,封闭后加入本室制备的rFⅧ-C1C2区蛋白,洗涤后加入待测稀释血浆,再次洗涤后加入HRP标记的羊抗人IgG,OPD显色,记录A490。以正常人血浆为对照,样本A490大于正常人对照3 SD定义阳性,通过ELISA法检测,82.1%(46/56)血友病A患者血浆抗因子同种抗体与因子Ⅷ的C区结合。中国汉族人血友病A患者血浆抑制物发病率并不低,以低滴度抑制物为主。ELISA法是一种快速而敏感的筛选血友病A患者血浆抗因子Ⅷ同种抗体的方法,该方法对于判断病情和指导临床治疗均有重要意义,绝大部分抗因子Ⅷ同种抗体与因子Ⅷ的C区结合。