大口黑鲈弹状病毒N、M基因的原核表达及生物学特性分析

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大口黑鲈(Micropterus salmoides)是我国重要的淡水经济养殖品种之一。随着养殖规模不断扩大,病害频发、种质资源退化等问题,已经严重影响了大口黑鲈产业的健康发展。其中较为严重的是由大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)引起的大口黑鲈弹状病毒病,可导致大口黑鲈苗种出现较高致死率,给苗种企业和养殖户造成巨大经济损失。截至目前,尚未研发出针对该病毒的有效药物或者疫苗,病原相关致病机制研究报道也较为缺乏。因此,本研究从大口黑鲈弹状病毒的致病性出发,以大口黑鲈弹状病毒核蛋白(nucleoprotein,N)、基质蛋白(matrix protein,M)为研究对象,通过生物信息预测、克隆表达、抗体制备、免疫印迹等多种方式在基因转录和表达水平分析它们的生物学特性,以期进一步探究MSRV的致病机制并为后继的疫苗开发、免疫防治及抗病育种等研究提供基础数据和理论参考。具体研究结果如下:(1)MSRV N、M基因的生物信息学分析通过测序获得MSRV N、M基因序列,并利用Pro Param、Prot Scale、Signal P4.1、TMHMM Server 2.0、PSORT II Server、Net Phos 3.1、SOPMA、SWISS-MODEL等多种在线工具或软件分别对N、M基因氨基酸序列进行生物信息学分析。N基因序列全长为1290 bp,编码429个氨基酸,其编码蛋白理论分子量大小为47.5k Da,理论等电点为5.52。N蛋白与鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)N蛋白同源性最高,序列相似度为94.87%。N蛋白是10个单体组成的圆环状,无信号肽和跨膜区,存在多种磷酸化位点。M基因序列全长为627 bp,编码208个氨基酸,其编码蛋白的理论分子量为23.1 k Da,理论等电点为7.7。M蛋白与SCRV M蛋白同源性最高,序列相似度为95.67%。M蛋白也无信号肽和跨膜区,存在多样化磷酸化位点,其三级结构近似圆筒状。(2)MSRV N、M基因的原核表达及多克隆抗体制备通过PCR扩增获得N、M基因编码序列,并成功构建重组质粒p EASY?-E1-N和p EASY?-E1-M。利用大肠杆菌原核表达系统诱导表达重组蛋白,结果表明N、M重组蛋白以包涵体形式存在。以纯化后的蛋白作为抗原注射接种大白兔获得了免疫抗血清,经检测N、M蛋白多克隆抗体效价均达到1:128000。通过Western-blot技术检测抗体特异性,发现N、M蛋白与制备的抗血清具有较强的杂交信号,表明N、M蛋白具有良好免疫原性能刺激机体产生特异性抗体。(3)N、M基因在MSRV感染大口黑鲈中的转录表达水平研究大口黑鲈被MSRV感染后会出现不规则或螺旋状游泳、鱼体弯曲和组织出血等临床症状,组织病理试验显示病毒会严重破坏大口黑鲈脑部、肝脏、肌肉和肠道等组织结构,导致组织发生明显的病理变化。N和M基因在大口黑鲈的头部、内脏、肌肉和尾鳍等组织中均有表达。所有检测时间段下,在头部和内脏组织中N基因的相对表达量要高于M基因;而在肌肉和尾鳍组织中N基因的相对表达量则低于M基因。在36 hpi时N、M基因在各组织中相对表达量达到峰值。(4)抗病免疫增强剂对MSRV增殖的影响筛选的游离核苷酸和黄芪多糖等多种免疫增强剂,在大口黑鲈饲料中分别添加进行拌喂后大口黑鲈存活率可提高25%~28%,且可有效抑制MSRV在大口黑鲈体内复制,MSRV感染后大口黑鲈各组织中N、M基因的相对表达量均低于未添加组。
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