近年来,在临床诊断、食品安全和环境保护等各个社会领域中,对生物分子的超灵敏检测要求越来越高,构建更为灵敏、精确、经济、简单的检测策略已成为生命分析科学领域中研究的重点和热点。生物分子信号放大技术是利用各种工具酶和纳米颗粒等手段发展起来的一种前沿的分析技术,可对生物分子进行快速、灵敏检测。本论文利用多种核酸工具酶、纳米颗粒以及核酸探针技术等现有的分子生物学技术和手段,主要以核酸、蛋白质等生物大分子和汞离子为研究对象,构建了多种新的荧光信号放大检测技术平台,实现了对核酸、蛋白质和汞离子的定量分析。主要内容包括:1、基于核酸适体保护和核酸外切酶循环放大构建免标记荧光检测方法检测凝血酶本章我们基于核酸外切酶Ⅲ辅助循环放大策略,核酸适体保护机制和锌原卟啉/G-四倍体超分子荧光标签构建了一种简单的、高灵敏的均相检测蛋白质的新方法。首先,这一创新性的检测平台设计简单,通过简单的混合及孵育即可实现,避免了繁琐的操作过程。通过利用核酸外切酶不但避免了洗涤及离心的过程,而且节省了时间。其次,适体探针不需要任何修饰和特殊标签,这不但降低了实验成本及设计的复杂性,而且保持了其与目标物结合的活性。此外,它对人凝血酶的检测限可达0.2 p M,并且通过改变对应的适体,该方法亦可广泛应用于其他类型生物分子的检测。因此,它在生物或临床目标物检测中具有很重要的应用价值。2、磁性纳米颗粒结合核酸外切酶辅助循环放大技术构建免标记荧光检测新方法定量检测DNA本章我们结合磁性纳米颗粒(MNPs)和核酸外切酶III(Exo III)辅助循环放大技术构建了一种能检测超低浓度目标DNA的新方法。我们巧妙设计的抓捕发卡探针(CHP)集多功能设计于一体,当目标DNA存在时,组装到磁性纳米颗粒上的抓捕发卡探针被打开,在核酸外切酶Ⅲ的辅助下实现连续的杂交与释放过程,不断释放出目标DNA和新引物。新的引物与GHP发卡探针杂交,核酸外切酶Ⅲ再次辅助循环放大,在锌原卟啉存在的情况下产生许多锌原卟啉/G-四倍体超分子复合物。利用两步循环放大策略和锌原卟啉/G-四倍体超分子荧光标签,该检测平台实现了对目标DNA的高灵敏检测,其检出限为0.75 f M。此外,该方法利用磁性纳米粒子作为分离和放大的媒介,在实际样品中具有较低的基体效应。所以,我们预期它在与基因相关的疾病的早期诊断中拥有很好的应用前景。3、基于滚环扩增反应和核酸外切酶III辅助循环放大的免标记荧光法检测DNA本章我们基于滚环扩增反应和核酸外切酶Ⅲ辅助循环放大策略,构建了一种高灵敏的荧光检测技术平台,实现了对目标DNA的免标记、高灵敏检测。第一步在核酸外切酶III辅助循环放大过程不断释放出目标DNA和新引物,目标DNA继续重复杂交和释放过程,新引物触发滚环扩增反应,滚环扩增产物在锌原卟啉存在的情况下产生Zn PPIX/G-四倍体超分子荧光标签,实现免标记。该检测平台线性响应范围涵盖7个数量级,检出限为0.51 a M。因而该方法在基因有关的疾病的早期诊断中具有很好的应用前景。4、基于甲基化切割触发的指数扩增灵敏的检测甲基酶的活性DNA甲基化作用的特异性位点识别和甲基化酶活性的检测对特定类型的癌症的确定、为基因表达机制提供见解、对开发可治疗甲基化相关疾病的新药物都有重要的意义。在此,在本章我们构建了一种基于甲基化切割触发的指数扩增反应和超分子的荧光标签—锌原卟啉/G-四倍体的高灵敏度荧光检测方法。在Dam甲基酶存在的情况下,发卡探针上甲基化响应序列被甲基化且被限制性内切酶Dpn I切割,触发指数扩增反应,实现信号放大。该方法线性响应范围为:0.0002-20 U/ml,检出限为:8.6×10-5U/ml,这比传统的检测方法都要高。这不仅提供了可以检测Dam甲基化酶活性和抑制性的检测平台,并且在生物过程研究、药物研发和临床诊断中具有很好的应用前景。5、构建一种基于哑铃型探针诱导RCA反应辅助的G-四倍体的免标记DNA荧光探针超灵敏检测Hg2+本章我们基于目标响应的哑铃型探针诱导的滚环扩增(D-RCA)策略构筑了一种新颖的免标记荧光检测方法,实现了对汞离子的高灵敏度、高选择性检测。我们设计了汞引物DNA(Hg2+-p-DNA)和一种集目标结合、扩增和信号传导为一体的多功能哑铃型探针。当汞离子存在时,汞引物与哑铃型探针形成稳定的T-Hg2+-T结构,并触发滚环扩增反应,产生许多串联的G-四倍体结构。在信号标签—N-甲基卟啉(NMM)存在的情况下,G-四倍体与N-甲基卟啉相互作用导致信号显著增强。通过这种方式,我们实现了对汞离子的放大检测,该方法的检出限为:80 f M,明显低于先前报道的生物传感器的检出限,线性动态范围涵盖5个数量级。我们利用这一高灵敏度、高选择性的检测方法检测了实际样品中汞离子的含量。