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目的本课题通过动物肾缺血再灌注模型和细胞缺血缺氧模型探讨急性肾损伤过程中炎症反应与细胞自噬发生之间的关系,并探索中药川穹嗪对急性肾损伤的保护作用及其可能的作用机制。方法本课题分为动物实验和细胞实验两部分。动物实验选用8周雄性SD大鼠27只,随机分为三组:对照组(Sham组)、缺血再灌注损伤组(ischemical reperfusion injury,I/R组)、缺血再灌注期间应用川穹嗪治疗组(I/R+TMP组)。检测血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)确定模型制作成功后,通过苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色、原位末端标记法(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL)、Caspase3/cleaved Caspase3 免疫组化染色观察各组肾小管形态学变化及细胞凋亡情况;Real time PCR检测NOD2、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、单核细胞趋化因子(MCP-1)的mRNA变化,观察炎症相关分子表达的变化;通过Western Blot检测肾脏NOD2、CD68等蛋白表达的变化,进一步验证各组炎症反应状态。细胞实验分为四组,即对照组、缺血再灌注损伤组(I/R组)、缺血再灌注期间应用川穹嗪组(I/R+TMP组)、缺血再灌注同时应用川穹嗉及自噬抑制剂组(I/R+TMP+CQ组)。构建两种缺血缺氧细胞模型模拟急性肾损伤状态:一种是使用CoC12处理细胞模拟缺氧;另一种是在低氧培养箱内培养细胞,通过建立氧-糖剥夺模型(Oxygen Glucose Deprivation,OGD模型)模拟缺氧状态。构建细胞模型成功后,通过Western Blot检测各组细胞中炎症相关蛋白及自噬相关蛋白的表达变化,进行TUNEL染色观察各组细胞的凋亡情况,通过CCK-8实验检测各组细胞活力变化。结果动物实验中,I/R组大鼠血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)显著高于对照组大鼠,而I/R+TMP组大鼠血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)高于对照组,但是低于I/R组;I/R组肾小管上皮细胞出现灶状或片状坏死,部分细胞脱落,脱落的上皮细胞与细胞碎片堵塞肾小管腔,I/R+TMP组这种损伤变化较轻;I/R+TMP组与I/R组相比,细胞凋亡减少。I/R组大鼠炎症介质(包括TNF-α、IL-6、MCP-1)水平升高,I/R+TMP组大鼠炎症介质水平升高的程度低于I/R组。CD68蛋白表达水平I/R组显著高于I/R+TMP组。在mRNA水平和蛋白水平I/R+TMP组NOD2的转录和表达上调不如I/R组明显。免疫组织化学染色也显示I/R组NOD2的表达水平升高显著高于I/R+TMP组。细胞实验中,使用不同浓度的CoC12处理NRK-52E细胞后,Western Blot结果显示NOD2表达水平均升高。低浓度(l00μM和250μM)(Co(C12处理后自噬相关蛋白Beclinl表达水平和LC3A/B-Ⅱ/Ⅰ比值升高,但是高浓度(500μM)CoC12处理后自噬相关蛋白Beclinl表达水平和LC3A/B-Ⅱ/Ⅰ比值均降低,。在两种缺血再灌注损伤细胞模型中,川穹嗪可以抑制NOD2表达上调的水平;川穹嗪处理组较缺血再灌注损伤组,自噬相关蛋白Beclinl表达水平和LC3A/B-Ⅱ/Ⅰ比值明显升高。应用自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)抑制自噬后,川穹嗪降低NOD2表达的作用减弱,反映自噬水平的LC3A/B-Ⅱ/Ⅰ比值降低。川穹嗪能够抑制促炎介质如TNF-α、IL-6和MCP-1的表达,自噬被抑制后其抑制炎症的作用减弱。自噬被抑制后,川穹嗪减少细胞凋亡的作用减弱。CCK-8(CellCountingKit-8)实验结果显示:自噬被抑制后,川穹嗪提高细胞活力的能力降低。结论急性肾损伤时NOD2的表达升高,与炎症介质一块共同加剧肾的缺血再灌注损伤,同时自噬的诱导受到抑制,应用川穹嗪可诱导自噬发生减轻炎症反应,从而对肾脏起到保护作用,这对于预防肾功能的恶化和为急性肾损伤的治疗提供了新的思路。