目的:研究铁死亡调控蛋白GPX4及SLC7A11在弱精症中的差异表达和作用机制;探讨铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）对精子冷冻损伤的保护作用。背景:目前研究认为ROS引起的氧化应激是导致弱精症的重要因素。而在精子冷冻保存中,氧化应激水平也与复苏后精子质量显著相关。铁死亡作为一种铁依赖的,脂质ROS积累的细胞死亡方式,参与了多种疾病的发展,而在男性不育中的作用尚不明确。因此本项目的初步研究结果为铁死亡在弱精症中和体外精子冻存中的作用提供了重要的实验数据和理论依据。研究方法:1、在公共基因表达数据库（gene expression omnibus）检索与弱精症相关的基因表达谱数据,下载GSE145467基因表达谱数据,选择其中精子发生正常组和精子发生功能障碍组,利用R语言包获得两组的差异表达基因,同时分析铁死亡相关基因的差异表达数据。2、自2021年1月-2021年9月,于重庆医科大学附属一医院生殖医学中心收集弱精症患者精液标本42例,正常精液标本45例。运用CASA分析精液常规参数;q RT-PCR检测精子中GPX4和SLC7A11m RNA水平,同时使用Western blot法检测蛋白水平;使用DCFH-DA荧光探针检测各组精子中活性氧（ROS）水平;使用线粒体膜电位检测试剂盒检测各组精子中线粒体膜电位（MMP）;使用铁离子检测试剂盒测定两组精液中铁离子水平;试剂盒使用丙二醛测定试剂盒检测各组精子中丙二醛（MDA）;进一步统计分析GPX4和SLC7A11及生化相关参数与精液参数的相关性,并探讨其临床意义。3、外源性给予H2O2处理正常精子,体外模拟氧化应激,同时设置铁死亡抑制剂Fer-1+H2O2共处理组,检测精子存活率和顶体反应的变化,同时检测铁死亡相关指标的改变和铁稳态调控蛋白的表达改变。4、自2021年8月-2022年1月,于重庆医科大学附属第一医院生殖医学中心收集健康生育男性精液标本,共计20份,每份精液一式5份,不含Fer-1者设为对照组（F0）,同时设置实验组,即冷冻保护剂中分别含有2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L Fer-1,作为F1、F2、F3和F4组。采用CASA分析冻前和冻后精子的前向运动能力和存活率;使用试剂盒测定冻存后各组精子ROS、MDA和MMP改变,同时检测GPX4和SLC7A11表达改变。研究结果:1、成功筛选出3561个差异基因,另外分析了23个铁死亡相关基因的表达量,发现与铁死亡相关的差异表达基因有12个,其中有6个基因表达上调,另外发现有包括GPX4在内的6个下调基因。2、弱精症患者精子中ROS、MDA及Fe2+水平较对照组显著增加,而MMP下降（p＜0.05）,铁死亡关键调控蛋白GPX4和SLC7A11在转录水平和蛋白质水平上显著低于正常对照组（p＜0.05）,且其m RNA水平与精子前向运动能力显著正相关性,与精子MDA含量及铁离子呈显著负相关。3、外源性H2O2处理优选正常精子后,精子存活率和顶体反应下降,精子细胞ROS、MDA及铁离子水平增加,MMP降低,GPX4和SLC7A11蛋白表达水平降低（p＜0.05）,铁稳态调节基因FTH1表达增加（p＜0.05）,使用铁死亡抑制剂Fer-1后可改善上述现象。4、冷冻复苏前后各组前向运动精子百分比及存活率均较新鲜精液明显下降（p＜0.01）,F2（5μmol/L）和F3（10μmol/L）组较F0组有明显改善（p＜0.05）;添加铁死亡抑制剂Fer-1后,各处理组中ROS水平均较未添加组（F0）显著下降（p＜0.05）;当Fer-1浓度为5μmol/L和10μmol/L后组MDA水平较F0组显著下降;当浓度为5μmol/L-20μmol/L时,MMP水平均显著高于F0组（p＜0.01）;检测GPX4和SLC7A11蛋白质表达水平发现,当Fer-1浓度为5μmol/L时,两者的表达水平均高于未添加组。结论:本研究证实了精子铁死亡可能是男性弱精症的潜在致病机制之一。关键铁死亡调控蛋白GPX4和SLC7A11表达水平在弱精症患者精子中下调,我们认为正是GPX4和SLC7A11的下调引起了精子ROS、MDA、Fe2+以及MMP等铁死亡指标改变,而铁稳态调节蛋白FTH1的升高,使细胞内铁离子稳态改变,促使精子对铁死亡敏感,造成精子运动功能受损,最终引起了弱精症的发生。冷冻保存能使精子的运动能力、活力显著降低,在精液冷冻保护剂中添加铁死亡抑制剂Fer-1可以减少脂质过氧化物和线粒体氧化损伤,且该过程可能与GPX4表达水平密切相关。提示在精子冷冻保存剂中添加Fer-1能有效提高精子质量,保护精子免受冻存损伤。