目的:自噬是一种进化上保守的分解代谢过程,对维持细胞稳态起着十分重要的作用。多年来自噬被认为是一种随机过程,随着科学研究的不断深入,越来越多的研究表明自噬是一种受到严格控制的选择性的过程。代谢重编程是恶性肿瘤细胞的显著特征之一,细胞代谢的改变使肿瘤细胞能够维持其日益增长的能量需求。由于恶性增殖的肿瘤细胞,通常以糖酵解的方式获得能量,所以大多数的肿瘤代谢研究都集中在糖代谢方面。在快速增殖的肿瘤细胞中,谷氨酰胺被大量消耗,谷氨酰胺代谢替代“Warburg效应”产生ATP,为肿瘤细胞提供能量,谷氨酰胺代谢逐渐被人们所重视。谷氨酰胺代谢由谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)催化脱氨开始,在线粒体中产生谷氨酸和氨。谷氨酰胺代谢发生在所有的增殖细胞中,在维持生物能量和为生物大分子合成提供氮、硫和碳骨架等方面发挥着关键作用。谷氨酰胺代谢在调节氧化还原平衡、mTOR信号传导等方面也起着重要的作用。此外,谷氨酰胺代谢是细胞氨的重要来源,它可诱导肿瘤细胞自噬。Bcl-2相关永生基因3(Bcl-2 associated athanogene,BAG3)是一种非常重要的分子,通过多种机制维持肿瘤细胞的致癌特性。BAG3的重要功能之一是通过调节应激条件下的选择性大自噬/自噬来降解错误折叠蛋白或蛋白聚集体,从而维持蛋白质的稳态。BAG3作为一种自噬调节分子,对维持细胞稳态起着至关重要的作用,近年来引起了人们的广泛关注。然而,BAG3调控自噬的分子机制尚未明确。本课题组前期研究证实,在蛋白酶体抑制剂的作用下,BAG3在不依赖于Beclin1和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PtdIns3k)的非经典自噬中起重要作用,利用shRNA下调BAG3的表达,能够显著抑制蛋白酶体抑制剂所诱导的自噬,但BAG3促进细胞自噬的分子机制尚未阐明。有文献报道GLS1能被沉默调节蛋白5(Sirtuin 5,SIRT5)去琥珀酰化,沉默SIRT5能够促进细胞谷氨酰胺代谢及细胞自噬,GLS的琥珀酰化位点仍不清楚。在前期工作中发现,BAG3能够提高细胞谷氨酰胺消耗速率、增加氨的生成及上调GLS的表达水平,并且BAG3增加了Lys158、Lys164位点的琥珀酰化水平。因此,我们推测BAG3可能通过促进GLS琥珀酰化上调其表达,从而促进谷氨酰胺代谢及细胞自噬。通过对BAG3调控细胞谷氨酰胺代谢及细胞自噬的机制进行解析,揭示BAG3上调GLS及其琥珀酰化的分子机理,明确GLS及其琥珀酰化在细胞能量代谢及细胞自噬中的重要作用,有助于为癌症治疗寻找新的药物靶点提供更加充实的理论和实验依据。研究方法:1、通过慢病毒感染的方式构建过表达BAG3、GLS及其突变体GLS(K158/164A)、GLS(K158/164E)的HepG2细胞和MCF7细胞,以及特异性shRNA慢病毒敲低GLS的HepG2-BAG3细胞和MCF7-BAG3细胞。2、应用Western blot检测BAG3、GLS、GLS(K158/164A)、GLS(K158/164E)及自噬相关蛋白表达情况。3、构建稳定转染pcDNA3.1-EGFP-LC3B质粒的HepG2细胞和MCF7细胞,之后通过慢病毒感染的方式过表达BAG3。4、荧光显微镜观察EGFP-LC3B自噬斑点的数量及分布。5、应用透射电镜技术观察过表达BAG3后自噬体变化情况。6、应用试剂盒检测培养液中谷氨酰胺的消耗情况。7、应用试剂盒检测细胞中谷氨酸和α-酮戊二酸的生成量。8、应用试剂盒检测培养液中氨的生成量。9、利用总RNA提取与纯化,反转录合成cDNA,RT-qPCR检测目的基因GLS总mRNA的表达水平。10、应用放线菌酮(CHX)抑制细胞内蛋白质合成,Western blot检测各时间点GLS及其突变体GLS(K158/164A)、GLS(K158/164E)的表达。11、应用质谱技术和IP检测GLS的琥珀酰化位点及琥珀酰化情况。12、应用免疫共沉淀技术检测蛋白质的相互作用。13、应用In vivo泛素化检测GLS及其突变体GLS(K158/164A)、GLS(K158/164E)的泛素化情况。结果:1、过表达BAG3诱导自噬。2、过表达BAG3诱导自噬不依赖于Beclin1和PtdIns3K。3、BAG3通过上调谷氨酰胺酶(GLS)促进自噬。4、BAG3通过抑制GLS的蛋白酶体降解来稳定GLS。5、过表达BAG3增加了GLS Lys158和Lys164位点的琥珀酰化水平。6、Lys158和Lys164位点的琥珀酰化通过抑制Lys48位的泛素化来稳定GLS。结论:BAG3通过下调SIRT5表达以及与GLS相互作用,促进GLS在Lys158和Lys164位点的琥珀酰化,抑制其蛋白酶体降解而稳定GLS,从而促进谷氨酰胺代谢并激活自噬。