研究背景及目的SARS、甲型H1N1流感病毒等引起的重症肺部感染可导致急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)。由于ALI/ARDS病情危重、预后差,其救治已成为目前全世界的重点话题。目前对于ALI/ARDS在内的急、慢性呼吸衰竭患者的有效救治手段主要有机械通气、ECMO等。其中机械通气作为最主要的手段之一,其使用不当即可导致呼吸机所致的肺损伤(Ventilator-induced lung injury, VILI)。虽然目前对于VILI的发生机制不完全清楚,但在VILI模型上可发现其病理上以弥漫肺泡损伤、肺泡—毛细血管渗透性增加并继发以中性粒细胞(Neutrophil, polymorphonuclear neutrophil, PMN)肺部浸润显著增加并伴随以BALF及全身循环中PMN升高为主的炎症反应等特征。既往研究显示PMN的过度激活可加重肺损伤,在VILI模型中PMN的过度激活与肺损伤程度密切相关,而针对PMN激活及其功能的各种干预手段[如中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)阻滞剂、PMN趋化因子MIP-2受体敲除等]可显著降低肺损伤的严重程度,故对PMN激活及其功能的干预有望成为防治VILI的有效手段。骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)是一种多能分化的干细胞,其在特定环境下可诱导分化为多种细胞(如软骨细胞、肌肉细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经细胞等)。在一些严重烧伤及损伤情况下使用MSCs时,MSCs可迅速趋向于损伤部位、获得一些损伤部位细胞的表型而发挥作用,且在肺损伤的研究中也显示其可获得肺部细胞表型、起到促进损伤修复等重要作用。此外,在脓毒症肺损伤的动物研究中显示MSCs使用可改善动物的预后,然而MSCs在VILI中使用是否也有类似作用目前仍缺乏相关报道。MSCs具有抑制免疫活性的功能,这可能是其促进损伤动物组织损伤修复的一个重要原因。其中MSCs与循环中的PMN、巨噬细胞、淋巴细胞、DC细胞及自然杀细胞等的相互作用在MSCs发挥其损伤修复作用时具有重要意义。新近研究表面MSCs-PMN的体外细胞实验、动物实验结果均提示MSCs可抑制PMN的激活。然而,MSCs在VILI模型中是否也能抑制PMN的激活目前仍未知。本研究假设MSC的输注可以通过调节PMN功能的激活在内的炎症反应和(或)通过MSC移植入肺并获得肺部细胞表型、重建损伤肺的结构及功能的途径进而减轻甚至预防大潮气量机械通气导致的肺损伤,对VILI模型起到保护作用。为此,本研究采用大潮气量机械通气来制备VILI模型,并在该模型中防治性使用MSCs以评价MSCs在VILI的作用。第一章大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定目的体外分离、培养雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并研究其生物学特性、表型特征及分化能力。方法在无菌条件下取出雄性SD大鼠股骨、胫骨,用冰L-DMEM培养基冲洗骨髓腔,离心取有核细胞,采用密度梯度离心法结合贴壁法分离、纯化大鼠MSCs,用含10%胎牛血清的L-DMEM培养基培养MSCs,去除非贴壁细胞。待细胞铺满瓶底面积约90%时,按1：2进行传代培养。用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率(Annexin-V/PI法),以明确体外培养目标细胞的生长特征；用MTT法通过描述细胞生长曲线以评价目标细胞的增殖活性；用流式细胞仪(FCM)检测培养的目标细胞表面CD分子CD34、CD45、CD29、CD44的表达,以鉴定目标细胞的纯度；用软骨细胞基础培养基加转化生长因子—β诱导目标细胞分化为软骨细胞,用免疫细胞化学法观察诱导的细胞表达Ⅱ型胶原的情况,以明确目标细胞的定向分化能力。结果从骨髓分离到的目标有核细胞大部分呈圆形,接种于培养基后72 h大部分细胞贴培养瓶壁、呈集落性生长,细胞形状变为梭形。培养10d-15d后,集落增多大部分融合成片并达到传代标准。细胞传代之后,细胞生长速度增快,约1周即可进行再次传代。在细胞传3代后,细胞形态仍为梭形、且形态较为均一。P3细胞中大部分细胞处于合成前期(G1期),其比例>80.0%；其次为处于DNA复制期(S期,约10.0%-12.0%)及DNA合成后期(G2期,约占6.0%-7.5%)的细胞,而静止期(G0期)及有丝分裂期(M期)的细胞占比例极少(G0+M期,约占0.0%-0.4%)；Annexin V/PI法检测目标细胞凋亡率均<5.0%。细胞在传代后第3d进入指数生长期,到第5d达到高峰；之后进入生长平台期。培养P3细胞表面CD29阳性表达率均大于99.50%、CD44阳性表达率均大于99.90%、CD34阳性表达率小于2.50%、CD45阳性表达率小于2.00%。在软骨细胞基质培养基内培养14d后,细胞外形变为多角形,胞浆中出现Ⅱ型胶原表达的占50%。结论本研究采用密度梯度离心法结合贴壁法可在体外分离、培养出SD大鼠来源的MSCs。用该方法培养出的MSC大部分处于增殖期,具有增殖活跃、存活率高、纯度高的特点,且其具有较高的分化能力。由于其生物学性状、表型稳定、分化能力较好,可用于进一步的动物实验研究。第二章大潮气量机械通气所致肺损伤大鼠模型的制备目的用大潮气量机械通气制备呼吸机所致肺损伤的SD大鼠模型。方法将250～260g体重的成年雌性SD大鼠腹腔内注射苯巴比妥钠麻醉后行气管切开插入气管导管,右颈内动脉留置头皮针。插管完毕后将动物分为三组：大潮气量机械通气组(VT20组,VT=20 ml/kg体重)、小潮气量机械通气组(VT8组,VT=8 ml/kg体重)、非机械通气对照组(不行机械通气,在插气管导管后大鼠自主呼吸)。各组n=12,以上机械通气组机械通气设置为：PEEP=2 cm H2O、RR=40次/分,吸呼比(I：E)均为1：2,吸入的气体均为空气,即吸入氧浓度(FiO2)均为21%。机械通气时间均为2h。机械通气组在导管置入完毕时(T0)、机械通气结束时(T2)、机械通气结束后2h时(T4)、机械通气结束后4h时(T6)等4个时间点分批取血标本后放血处死动物,而非机械通气对照组则在插管完毕时(T0)、插管完毕后2h(T2)、4h(T4)、6h(T6)分批取血标本后放血处死动物。各组各时点均取3只动物。观察并比较各组各时点动脉血气、肺干湿比、肺泡灌洗液内PMN数量、肺组织病理。结果1)各组大鼠在整个实验过程中pH值进行性下降,各时间点间差异有统计学意义(F=9.029,P=0.001),但组间差异无统计学差异(F=1.347,P=0.329)。VT20组在T2时动脉血PaO2/氧合指数(OI)较TO时显著下降(均P=0.016),但机械通气后组内各时间点前后动脉血PaO2/OI差异均无统计学意义(T2比T4,P=0.775;T4比T6,P=0.338)；其它各组组内PaO2/OI差异也均无统计学意义(对照组F=0.603,P=0.531；VT8组F=2.901,P=0.206)。动脉血PaCO2的变化上,分组、时间因素均无显著影响(时间因素：F=3.503,P=0.082；分组因素：F=0.874,P=0.464)。VT20组在T4时动脉血[HCO3-]浓度较T0、T2均下降,差异有统计学意义(均P=0.022)；之后维持在T4水平(T6比T4,P=0.497)；而对照组及VT8组在实验过程中[HCO3-]浓度组内差异均无统计学意义(对照组F=4.200,P=0.064；VT8组F=4.659,P=0.149)。2)对照组及VT8组动物肺湿干比组内各时点间差异无统计学意义(对照组F=0.336,P=0.658；VT8组F=2.017,P=0.272)；而VT20组动物肺湿干比在机械通气后随时间增加而增加,T6时与T0时比较差异有统计学意义(P=0.019)。3)对照组及VT8组动物肺组织病理随时间变化不大,但VT20组出现双上肺明显肿胀、包膜下血性渗出,弹性较前明显降低,肺间质水肿、PMN浸润,肺泡腔内出现大量血性液体渗出、且肺泡腔内出现以PMN为主的细胞渗出,部分肺组织实变及肺泡出血等损伤改变。且VT20组动物肺泡灌洗液内PMN数量也随着时间推移而增加,组内各时点差异有统计学意义(F=93.782,P=0.000)。结论用20ml/kg体重的潮气量对SD大鼠进行为期2h的机械通气可导致大鼠氧合障碍、肺部出现间质水肿、肺泡渗出及PMN浸润为主等急性肺损伤的病理改变,可见本研究采用20ml/kg潮气量对大鼠行机械通气2h可成功制备VILI大鼠模型。该研究可为下一步研究提供VILI动物模型。第三章MSC给予对于VILI模型肺损伤及炎症反应的影响目的明确MSC对VILI模型肺组织损伤及局部、全身炎症反应的影响。方法将30只体重为250～260g的成年雌性SD大鼠麻醉后气管切开插管,右颈内动脉留置头皮针。插管完毕后将动物分为5组：正常对照组(control组)、MSC给予组(MSC组)、大潮气量机械通气组(VT20组)、MSCs预给予+大潮气量机械通气组(MSC+VT20组,在大潮气量机械通气前给予MSCs)、大潮气量机械通气+MSCs后给予组(VT20+MSC组,在大潮气量机械通气结束后立即给予MSCs)。各组n=6,机械通气组机械通气参数为：VT=20 ml/kg体重,PEEP=2 cm H2O, RR=40次/分,吸呼比(I：E)均为1：2,FiO2=21%。机械通气时间均为2h,机械通气结束后给予去除机械通气自主呼吸4h,之后处死动物。非机械通气组在插管完毕后6h处死动物。MSCs给予组均静脉给予每只大鼠数量为3×106/L的MSCs,而未给予MSC组在插管2h后给予静脉注射等体积生理盐水(0.5ml)。动态观察各组大鼠血气变化、肺组织病理、对肺组织损伤进行评分(Smith评分)、肺组织内PMN浸润数量、BALF中PMN数量、BALF及循环中促炎因子(TNF-α、IL-6、MIP-2)及抗炎因子(IL-10)的变化情况,并将以上指标进行组间比较。结果1)机械通气各组(包括VT20组、MSC+VT20组及VT20+MSC组)在机械通气后动脉血PaO2较T0时下降,组内差异只有VT20组有统计学意义(P分别为0.001、0.359、0.147)；机械通气后MSC+VT20组各时点Pa02均较VT20组增高,但只有T2时差异才有统计学意义(T2、T4及T6,P分别为0.035、0.050、0.053)。2)给予MSC对正常大鼠肺部病理组织无显著影响,而VT20可导致大鼠肺部出现肺间质水肿、PMN浸润,肺泡腔内出现大量的血性液体渗出、且肺泡腔内出现以PMN为主的细胞渗出,部分肺组织实变及肺泡出血等损伤改变。而MSC+VT20组肺组织病理仅见部分肺间质稍增厚及较少量PMN浸润,而VT20+MSC组部分肺间质进一步增厚、PMN浸润明显减少等改变。肺损伤评分组间差异有统计学意义(F=68.131,P=0.000)。而肺组织病理高倍视野下PMN数量、BALF中PMN计数量组间差异同样也有统计学意义(肺组织：F=43.039,P=0.000：BALF:F=134.171,P=0.000)。3)各组动物BALF中TNF-α、IL-6、MIP-2及IL-10的浓度组间差异有统计学意义(TNF-α:F=69.706, P=0.000; IL-6:F=155.816,P=0.000；MIP-2:F=120.529,P=0.000；IL-10：F=42.154,P=0.000),其中VT20组BALF中TNF-α、IL-6、MIP-2及IL-10的浓度均较对照组高,且组间差异有统计学意义(均P=0.000);MSC+VT20组BALF中TNF-α、H-6、MIP-2浓度较VT20组低,组间差异有统计学意义(P分别为0.000、0.025、0.009);而VT20+MSC组与VT20组比较时,BALF的TNF-α、MIP-2水平组间差异有统计学意义(P分别为0.031、0.012),但组间BALF的IL-6差异无统计学意义(P=0.995)；此外,MSC+VT20组、VT20+MSC组的IL-10水平分别与VT20组IL-10比较时,组间差异也无统计学意义(P分别为0.117、0.556)。4)机械通气损伤后(包括T2、T4、T6)大鼠血浆TNF-α、IL-6、MIP-2及IL-10的浓度均较T0时升高,且各指标组内差异均有统计学意义(均P=0.000),而MSC+VT20组机械通气后(T4、T6)血浆TNF-α、IL-6、MIP-2的浓度较VT20组的低(TNF-α：P分别为0.000、0.003；IL-6：P分别为0.003、0.011；MIP-2：P分别为0.997、0.002)；VT20+MSC组机械通气后与VT20组比较时,T6时组间血浆TNF-α、MIP-2的浓度差异有统计学意义(P分别为0.039、0.033),而IL-6浓度组间差异无统计学意义(P分别为1.000、0.469、0.978)。而MSC+VT20组、VT20+MSC组在机械通气后血浆IL-10水平与同一时点的VT20组血浆工L-10水平比较,组间差异均无统计学意义(P分别为0.804、0.995、1.000,0.557、1.000、0.966)。结论MSCs给予可在不同程度上减轻大潮气量机械通气所致的肺部组织损伤、氧合恶化、肺部PMN浸润、局部及全身与PMN有关的炎症介质的释放量,且MSCs给予时间越早,这些作用就越明显；但MSCs给予但对VILI模型抗炎介质IL-10的释放量无显著影响。MSCs使用在降低肺损伤程度的同时也伴随着肺部浸润PMN数量的降低。这提示MSCs输注可为VILI模型提供一个相对稳定的内环境,这有助于提高动物对不当机械通气的耐受程度及防治VILI后继的以PMN为主的炎症及其所致的肺部进一步损伤。第四章MSC处理对VILI大鼠PMN功能的影响目的明确MSC对VILI模型SD大鼠PMN功能的影响。方法将对照组(control组)、MSC给予组(MSC组)、大潮气量机械通气组(VT20组)、MSCs预给予+大潮气量机械通气组(MSC+VT20组,在大潮气量机械通气前给予MSCs)、大潮气量机械通气+MSCs后给予组(VT20+MSC组,在大潮气量机械通气结束后立即给予MSCs)大鼠在机械通气后4h后取的血标本及处死后取BALF的标本,用流式细胞仪检测其中PMN的细胞内ROS含量及表面分子CDllb的表达；分离血标本、BALF标本中的PMN,用流式细胞术进行凋亡率检测；利用化学发光法进行血浆、BALF中NE活性定量检测；用Fenton反应检测血浆及BALF中的ROS (·OH含量),以确定细胞外ROS含量；并将NE活性、细胞表面CD11b表大量、细胞内ROS含量、细胞外ROS含量、PMN细胞凋亡率资料进行组间比较。结果1)血及BALF中PMN细胞表面CDllb表达量组间差异均无统计学意义(血：F=1.008,P=0.442;BALF:F=0.328,P=0.856)。2)血及BALF中NE活性各组间差异有统计学意义(F分别为39.813、31.061,均P=0.000)。其中VT20组血及BALF中NE活性均较对照组高,差异有统计学意义(均P=0.000)；MSC+VT20组血及BALF中NE活性均较VT20组降低,差异有统计学意义(均P=0.000)；且VT20+MSC组与VT20组组间血及BALF中的NE活性差异均有统计学意义(血：P=0.035,BALF:P=0.040)；但MSC+VT20组与VT20+MSC组组血浆及BALF的NE活性间差异无统计学意义(血：P=0.927,BALF:P=1.000)。3)血及BALF中PMN内ROS含量各组间差异均有统计学意义(F分别为986.470、118.612,均P=0.000)。VT20组血及BALF中PMN内ROS含量较对照组增高,且差异有统计学意义(均P=0.000);MSCs使用组(包括MSC+VT20组、VT20+MSC组)细胞内ROS产量均较VT20组低,与VT20组比较差异均有统计学意义(除BALF中MSC+VT20组与VT20组比较P=0.001外,其它均P=0.000)；且MSC+VT20组、VT20+MSC组比较时,组间BALF来源的PMN内ROS含量的差异也有统计学意义(P=0.000)。4)血浆及BALF中ROS含量各组间差异有统计学意义(F分别为19.597、198.991,均P=0.000)。其中VT20组血浆及BALF中ROS含量均较对照组低,组间差异均有统计学意义(均P=0.000)；MSC+VT20组血浆及BALF中的ROS含量较VT20组降低,组间差异均有统计学意义(均P=0.000)；而VT20+MSC组只有BALF中ROS含量较VT20组低,组间差异有统计学意义(P=0.001);且MSC+VT20组、VT20+MSC组比较时,血浆、BALF中ROS含量组间差异均有统计学意义(P分别为0.001、0.021)。5)血及BALF来源的PMN细胞凋亡率各组间差异有统计学意义(F分别为41.869、89.661,均P=0.000)。其中VT20组血及BALF来源的PMN凋亡率均较对照组降低,且组间差异有统计学意义(均P=0.000)；而MSC给予组中只有MSC+VT20组血中PMN的凋亡率较VT20组高,差异有统计学意义(P=0.001)。结论大潮气量机械通气所致的肺损伤大鼠模型中存在PMN的过度激活,其主要表现在NE活性增高、细胞内外ROS产量增加、细胞凋亡减少及延迟等。而MSCs的给予在不同程度上降低NE活性及ROS的产生量,尤其是损伤前给予MSCs时PMN功能激活相关指标降低量更为明显。这表面MSCs有调节PMN功能的能力,且MSC给予时间越早则对PMN功能调节作用越明显。第五章MSC静脉输注对于VILI模型预后的影响及MSCs输注后在肺部转化情况观察目的明确MSCs静脉内注射能否改善VILI模型的预后与及其是否能迁移到VILI大鼠的肺部、替代损伤组织细胞、甚至获得肺部损伤细胞的表型及发挥相应功能。方法取45只体重为250～260g的成年雌性SD大鼠麻醉、气管切开插管后随机分为大潮气量机械通气组b(VT20组b)、MSCs预给予+大潮气量机械通气组(MSC+VT20组b,在大潮气量机械通气前给予MSCs)、大潮气量机械通气+MSCs后给予组(VT20+MSC组b,在大潮气量机械通气结束后立即给予MSCs),各组n=15,机械通气组机械通气参数为：VT=20ml/kg体重,PEEP= 2 cm H20,RR=40次/分,吸呼比(I：E)为1：2,吸入气氧浓度(FiO2)为21%,机械通气时间为2h。机械通气结束后拔除呼吸机接头、缝合颈部切口后放置回实验笼中,让动物自主呼吸空气。在随后的14d内每24h观察并记录一次动物的存亡情况。取6只体重相近的成年雌性SD大鼠作MSC长期观察组(MSC组b)经尾静脉注射MSCs,之后放回养殖笼中继续养殖14d。MSCs均为雄性大鼠来源的,数量均为3×106/L每只大鼠。取MSC组、MSC+VT20组、VT20+MSC组、MSC组b、MSC+VT20组b及VT20+MSC组b动物各6只处死后取肺行免疫组织化学检测抗SRY抗体阳性的细胞、PCR检测肺组织中大鼠Y染色体上的Sry基因片段以明确静脉注射雄性大鼠来源的MSCs后是否能滞留在肺部、较长时期后肺部是否有雄性大鼠来源的细胞存在及其存在的部位。结果MSC+VT20组b、VT20+MSC组b及VT20组b动物致伤后48h内生存率分别为73.33%、73.33%、66.67%,三组组间差异无统计学意义(χ2=0.216,P=0.897)；14d内生存率分别为53.33.00%、40.00%、40.00%,各组动物14d内死亡率差异也无统计学意义(χ2=0.720,P=0.698)。免疫组化、PCR结果提示MSCs输注后短期实验结束时各组动物均有MSCs滞留在肺部,其中在MSC组MSCs较均匀分布在肺毛细血管床内；而MSC+VT20组MSCs分布较MSC组较为局限,量较MSC组少,且差异有统计学意义(P=0.000)；而VT20+MSC组MSCs则分布在肺间质明显增厚的毛细血管床内,分布成片带状,量较MSC+VT20组要少,差异有统计学意义(P=0.000)。而在MSC输注后14d后MSC组b、MSC+VT20组b及VT20+MSC组b三组动物的肺组织中均未检出抗Y染色体特异性结合蛋白抗体阳性细胞及Y染色体Sry片段。结论MSCs静脉内输注短期内可出现在VILI动物肺部,而组织损伤可减少MSCs在肺部的滞留数量,而MSCs并未移植到肺部、也未分化为肺部细胞并取代损伤细胞的功能。MSC细胞静脉内输注虽可将VILI大鼠14d生存率从40%提高到53.33%,但由于例数较少,仍需进一步扩大样本方可确认MSCs干预能否改善VILI模型14d内生存率。全文总结利用密度梯度离心法联合离心法可分离、体外培养出增殖能力强、纯度高、分化能力强、性状稳定的MSCs.而大潮气量短期机械通气可制备VILI模型,该模型病理上以PMN肺部浸润增加为主要特征,同时伴随与PMN相关的局部及全身炎症反应。在VILI大鼠模型中进行静脉内输注MSCs可减轻VILI大鼠继发的以PMN肺部浸润及PMN功能激活在内的炎症反应及肺损伤,而使用时机越早其保护作用越明显。而MSC在VILI动物模型中的保护作用并非通过MSCs移植入肺、获得肺部细胞表型、重建损伤肺细胞的结构和功能,而是通过调节PMN的功能激活在内的炎症反应。这提示临床有望使用MSCs来调节PMN功能激活为主要特征的炎症反应模式为有发生VILI风险的机械通气者提供稳定的内环境及提高其对不当机械通气的耐受能力,以达到防治VILI的目的。