论文部分内容阅读
目的：根据中医学肾藏精主骨理论,观察滋补肾精方对肾精亏虚证小鼠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)表达水平的调节,研究滋补肾精方含药血清对小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)增殖、细胞周期、碱性磷酸酶(ALP)活性和IGF-lmRNA表达的影响,共同探讨肾精亏虚证中以IGF-1为主的调节机制,以及使用补肾填精中药干预的效果,揭示肾藏精主骨的理论本质,为肾精亏虚证及相应疾病的治疗提供依据。方法：1.动物实验：将50只小鼠随机分为正常组、模型组、金匮肾气丸组以及滋补肾精方高、低剂量组。除正常组外,其余4组采用恐伤肾联合力竭游泳建立肾精亏虚证动物模型,造模同时模型组灌胃生理盐水(0.02ml·g-1·d-1)、金匮肾气丸组灌胃金匮肾气丸混悬液(2.7g·kg-1·d-1),滋补肾精方高、低剂量组分别灌胃滋补肾精方(20g·kg-1.d-1、10g·kg-1.d-1),连续21d。观察小鼠一般状况,称量小鼠体质量,实验结束后用酶联免疫吸附法(ELISA)测定肝组织胰岛样生长因子-1(IGF-1)和血清胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)的含量,并观察使用补肾填精中药治疗后上述指标的变化。2.细胞实验：由动物实验确定滋补肾精力最佳药物剂量后,制备含药血清,复苏小鼠成骨细胞株(MC3T3-E1)加入不同浓度滋补肾精方含药血清和生理盐水对照血清(2.5%、5%、10%、20%、40%)培养细胞24、48、72小时,观察细胞增殖情况并确定最仕含药血清浓度。用最佳浓度含药血清和生理盐水血清干预成骨细胞24、48、72小时后,流式细胞仪测定细胞周期,对硝基酚磷酸盐法检测细胞ALP活性,半定量RT-PCR检测细胞IGF-lmRNA的表达,并观察上述指标随细胞培养时间延长的变化。3.统计学方法：结果以平均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS19.0统计软件分析数据,one-way ANOVA进行显著性检验,,检验进行组间比较,以P<0.05为有显著性差异。结果：1.模型组小鼠一般状况符合中医理论中肾精亏虚证候学特点,肝脏组织中IGF-1及血清中IGFBP-3含量均降低。使用滋补肾精方能够改善小鼠肾精亏虚证的证候表现,提高小鼠肝组织IGF-1和血清IGFBP-3水平,其中滋补肾精方高剂量组效果最明显。2.与同浓度生理盐水血清对照组相比,不同浓度滋补肾精方含药血清组MC3T3-E1细胞增殖能力不同程度的增强,其中20%浓度滋补肾精方含药血清促增殖作用最显著。用20%最佳浓度的含药血清干预MC3T3-E1细胞24、48、72h,与生理盐水血清相比,均能明显降低G0/G1期细胞比例,提高S期细胞比例及增殖指数,提高细胞内及细胞上清液中ALP活性,提高细胞IGF-lmRNA表达水平,且上述指标的变化随着细胞培养时间的延长变化越显著。结论：1.滋补肾精方可能通过调节机体IGF-l、IGFBP-3水平,发挥对肾精亏虚证的治疗作用。2.滋补肾精方含药血清能促进成骨细胞增殖,推动成骨细胞周期进程,调节成骨细胞ALP活性、IGF-lmRNA表达。3.通过动物实验和细胞实验,从细胞分子水平说明了中医肾主骨理论的准确性,解明了肾精亏虚证的本质,为肾精不足证的治疗提供了依据。