疾病、外伤等各种原因造成角膜缘干细胞缺如或功能不良时,角膜透明性丧失,严重影响视力,通常最佳的方法是自体角膜缘移植。但对于双眼角膜缘广泛损伤的患者,自体角膜缘干细胞严重缺乏而限制了此治疗方式。近年来非眼源性干细胞在角膜上皮重建中的研究和应用受到重视,主要集中在胚胎干细胞、口腔黏膜祖细胞、骨髓间充质干细胞和表皮干细胞等。目前认为毛囊外根鞘的bulge区域存在大量的成体干细胞,其取材简便,来源丰富,且具有多向分化能力,正作为一种新兴的种子细胞。本实验的目的是探讨毛囊bulge区的干细胞是否具有向角膜上皮细胞转分化的能力,并能够作为修复角膜上皮的一种细胞来源。研究表明,干细胞的分化与转分化常受多种因素的调节,Pax6在角膜上皮发育分化中具有主控作用,并在维持角膜上皮的正常功能中具有不可忽视的功能;Wnt信号途径也对许多成体干细胞包括毛囊干细胞的增殖分化起重要的调节作用。为此,本论文首先研究在体外特定诱导环境中毛囊bulge干细胞向角膜上皮细胞转分化的能力,并对诱导分化过程中Pax6和β-catenin/Lef-1的表达变化进行研究。继后重点研究了Pax6的作用机制,最后对毛囊bulge干细胞在体内重建角膜上皮的作用进行了观察,主要结果如下:1、毛囊bulge干细胞培养鉴定和生物学性状的研究采用Ⅳ型胶原快速黏附的方法富集毛囊bulge区干细胞,体外培养,并对其生物学性状进行检测。结果发现:Ⅳ型胶原筛选的方法能较好地获得毛囊bulge干细胞并进行体外培养。细胞形态均一,核浆比大,表现出早期幼稚细胞的形态特征。细胞克隆形成率结果显示细胞具有较强的增殖能力,克隆形成率高。体外培养的毛囊bulge干细胞表达特异性标志CD34和整联蛋白α6。2、毛囊bulge干细胞向角膜上皮样细胞的体外诱导分化在体外成功培养毛囊bulge干细胞的基础上,我们用角膜缘的组织匀浆制备诱导培养基,诱导毛囊bulge干细胞分化。结果发现:毛囊bulge干细胞在体外适当的诱导培养条件下能转分化为角膜上皮样细胞,表达角膜上皮特异性标志K12。在毛囊bulge干细胞转分化的过程中,Pax6的表达上调,对转分化过程起促进作用。在毛囊bulge干细胞转分化的过程中,Wnt信号途径受到抑制,表现为Lef-1表达下降,β-catenin从胞核向胞浆转位。诱导分化后的细胞能在体外形成类似正常角膜上皮的屏障功能。3、Pax6在角膜上皮样细胞分化中的作用实验中发现大鼠触须中的毛囊组织中也有Pax6的表达,与角膜上皮类似,但不同的是表达以另一个剪接体Pax6-5a为主。通过转染使毛囊bulge干细胞过表达Pax6发现,Pax6能启动部分毛囊bulge干细胞表达角蛋白K12,提示毛囊bulge干细胞转分化过程中Pax6发挥了重要的作用,该作用是直接调节角膜上皮特异性角蛋白K12的表达。但Pax6的过表达并不能抑制β-catenin和Lef-1的作用,只有在条件培养基中才能引起β-catenin和Lef-1的下调,说明转分化过程中β-catenin和Lef-1的下调来源于角膜缘微环境的作用,与角膜组织中的DKK2的表达有关。4、毛囊bulge干细胞在体重建角膜上皮的作用运用碱烧伤处理制备角膜缘干细胞缺失病理动物模型,借助一种新型温度敏感型生物材料PIPAAm制备无载体的细胞片层移植到受损的角膜表面。结果发现毛囊bulge干细胞能够重建受损的角膜上皮,能改善角膜的透明度,抑制新生血管的形成。毛囊bulge干细胞能够在角膜表面形成K12表达阳性的上皮层。毛囊bulge干细胞的修复能抑制MMP2和MMP9的表达,具有一定的抑制炎症的作用,然而具体机制还有待进一步探讨。主要结论:本实验发现毛囊bulge干细胞在体外具有向角膜上皮样细胞转分化的能力,在诱导分化的过程中Pax6上调,而β-catenin和Lef-1受到抑制。其中Pax6是调节角膜上皮特异性角蛋白K12表达的重要因子。毛囊bulge干细胞在体内也能转分化为角膜上皮样细胞,重建受损的角膜上皮。该实验为角膜上皮重建中种子细胞的来源开辟了一个新的途径,也为角膜上皮重建的方法提供新的策略。