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研究背景 随着人们生活水平的不断提高和疾病谱的变化,慢性非传染性疾病已经成为严重威胁人类生命和健康的常见病和多发病,其中在世界范围内,心脑血管疾病具有较高的发病率与病死率,已位于死因顺位的前列。而动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是多种心、脑血管病发生发展的病理生理学基础。关于动脉粥样硬化的病因学和发病学存在诸多观点。近年来大量流行病学研究证实,高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia,HHcy)作为AS发生发展过程中一个新的、重要的独立危险因素越来越受到广大学者的广泛重视,但其介导动脉粥样硬化发生的确切的生物化学和分子机制尚未充分阐明,因而尚缺乏对AS及心脑血管疾病行之有效的干预防治手段。因此,深入探讨动脉粥样硬化性疾病的病因学和发病学,从生物化学和分子生物学水平揭示动脉粥样硬化发生发展的机制,并在此基础上寻求行之有效的干预防治途径和线索具有重要的理论和实用意义。叶黄素(Lutein)是一种天然植物化学物。分子式:C40H56O2,分子量:568.85。结构上属于含氧类胡萝卜素。与其他含羟基类胡萝卜素相比,叶黄素分子的两边分别含一个β-紫罗酮环和一个ε-紫罗酮环以及多个共轭不饱和双键,这种特殊的化学结构赋予其很强的抗氧化活性和多种生物学功能。大量流行病学调查和动物实验证实,叶黄素在动脉粥样硬化的发生发展过程中具有保护作用,但其确切的生化和分子机制尚不明晰。尤其是叶黄素对高同型半胱氨酸致动脉粥样硬化发生的干预阻断的效应及机制研究国内尚未见诸报道,成为本研究的切入点所在。目的 1.揭示冠心病患者血液同型半胱氨酸水平与氧化应激状态的相关关系。2.从生物化学和分子生物学层面探讨实验性高同型半胱氨酸血症大鼠机体的氧化应激(oxidative stress)状态,反应血管内皮功能的一氧化氮(nitric oxide,NO)和内皮素-1(endothelin-1,ET-1)水平的改变以及一些炎症相关信息分子包括核转录因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)以及细胞间黏附分子-1(interce llular adhesion molecule-1,ICAM-1)基因表达改变,并采用业已证实具有抗氧化作用的植物化学物叶黄素(Lutein)进行干预处理,进一步揭示和佐证HHcy介导动脉粥样硬化发生的可能分子机制。最终期望能获取基于该分子机制的行之有效的干预动脉粥样硬化发生发展的新线索和新途径。方法 1.对冠心病患者实施血清同型半胱氨酸(Hcy)水平,以及反应机体氧化应激状态的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathine peroxidease,GPx)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活力以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的测定。揭示冠心病患者的血浆Hcy水平,机体的氧化/抗氧化平衡状态以及冠心病机体Hcy水平与氧化应激状态的相关关系。2.构建高同型半胱氨酸血症Wistar大鼠模型。将实验动物随机分为4组:空白对照组,模型组,叶酸组干预组及叶黄素(Lutein)干预组。空白对照组(10只):1%羧甲基纤维素钠(CMC)液2 ml灌胃,每日1次,然后给予正常饲料,共8周。模型组(10只):3%蛋氨酸混悬液(1.5g/kg体质量)灌胃,每日1次,然后给予正常饲料,共8周。叶酸干预处理组(10只):3%蛋氨酸混悬液,加叶酸混悬液(60mg/Kg体质量)灌胃,每日1次,然后给予正常饲料,共8周。叶黄素干预处理组(10只):3%蛋氨酸混悬液,加叶黄素混悬液(20mg/kg体质量)灌胃,每日1次,然后给予正常饲料,共8周。3.各组实验动物喂养至8周末,腹腔注射体积分数10%水合氯醛麻醉,心脏取血,离心分离血清。标本于-80°C冰箱保存。测定各组动物血清Hcy浓度及其它指标包括血清SOD、GPx、CAT活性,血清MDA含量及羟自由基(OH?)水平,血清总抗氧化能力(T-AOC),血清NO及ET-1的含量。4.采取各组大鼠部分主动脉血管壁组织,用RT-PCR及Western blot技术检测主动脉血管壁组织SOD2、GPx1、NF-κBp65以及ICAM-1的m RNA及蛋白表达水平。结果 1.研究结果显示,冠心病患者血浆清Hcy显著高于对照组,进一步证实血清Hcy升高是冠心病发生发展的一个独立危险因素。本研究结果亦显示,冠心病患者MDA含量显著高于正常组,而起重要抗氧化防御作用的SOD、GPx的活力则较对照组显著性降低。揭示冠心病的发生涉及自由基代谢的紊乱和氧化/抗氧化状态的失衡,表现为氧化应激的亢奋状态。本研究结果还显示,冠心病患者血清Hcy含量与反应机体氧化应激状态的MDA含量进行相关分析表明,两者存在正相关关系。综合研究结果显示,冠心病患者机体氧化应激的亢奋状态,可能是血清高Hcy介导动脉硬化发生的机制之一。2.成功复制了大鼠HHcy动物模型,探讨了其介导动脉硬化发生的氧化应激分子机制,并在此基础上采用业已证实具有很强抗氧化作用的天然植物化学物叶黄素(Lutein)进行干预处理。3.结果显示,与对照组相比,HHcy模型大鼠血清SOD及GPx活性显著降低,MDA含量及羟自由基水平则显著升高,总抗氧化能力T-AOC显著下降。表明HHcy模型大鼠机体亦处于氧化应激的增强状态。而Lutein干预组大鼠血清SOD及GPx活性则显著升高,MDA含量及羟自由基水平显著下降,总抗氧化能力T-AOC显著增加,揭示Lutein可抵御HHcy模型大鼠诱发的氧化应力亢奋。4.结果还显示,模型组大鼠血浆NO水平显著降低,ET-1水平显著升高,表明HHcy可籍此介导血管内皮功能的障碍。而Lutein干预组大鼠血清NO水平显著升高,ET-1水平显著下降。提示Lutein可逆转HHcy诱导的血管内皮功能障碍。5.用RT-PCR及Western Blot检测结果亦显示,HHcy模型大鼠主动脉血管壁组织中反映氧化应激水平的抗氧化酶SOD2及GPx1的m RNA及蛋白表达降低,炎性相关信息分子NF-κBP65及细胞粘附因子ICAM-1的表达增强。而Lutein干预组大鼠主动脉内皮SOD2及GPx1的m RNA水平及蛋白表达上调,NF-κBP65及ICAM-1的表达下调。结论 1.冠心病患者血清Hcy水平显著高于正常人,且机体处于氧化应激的亢分状态。相关分析表明,冠心病患者血浆Hcy水平与机体氧化应激的加强存在相关关系。结果佐证了血浆Hcy水平升高是冠心病发生的重要危险因子之一,并且可能通过氧化应激机制介导。2.动物实验结果显示,HHcy模型大鼠机体亦存在氧化应激状态的加强,表现为抗氧化酶SOD、GPx活性的降低,脂质过氧化水平增强。同时模型组大鼠血浆NO水平降低,ET-1水平升高,表明HHcy介导血管内皮功能障碍。用RT-PCR及Western Blot检测结果亦显示,HHcy模型大鼠主动脉内皮中反映氧化应激水平的抗氧化酶SOD2及GPx1的m RNA水平及蛋白表达降低,而炎性相关信息分子NF-κB P65及细胞粘附因子ICAM-1的表达增强。3.首次采用Lutein对HHcy模型大鼠的干预研究结果显示,Lutein虽然没有显著降低血清Hcy的作用,但可显著干预和改变Hcy所介导的生物化学行为变化。表现为可上调抗氧化酶SOD2和GPx1的表达,提高机体的抗氧化应激能力,同时下调NF-κBP65及ICAM-1的基因表达。结果提示,Lutein对动脉粥样硬化早期的干预保护作用,可能源于Lutein作为抗氧化剂的直接作用,而非通过降低血清同型半胱氨酸水平而发挥的间接作用。4.综合研究结果显示:HHcy是动脉粥样硬化发生的独立危险因素之一。氧化应激和炎症是其介导动脉粥样硬化发生的重要分子机制。尤其是HHcy诱导的氧化应激加剧,可能是HHcy介导动脉粥样硬化发生的始动机制,进一步引发NF-κB及其包括ICAM-1在内的下游炎症因子的表达,从而关联动脉粥样硬化的形成和发展。Lutein可显著干预抑制Hcy所介导的氧化应激的亢奋,下调炎性相关信息分子的表达,从分子层面为Lutein用于动脉粥样硬化形成和发展的有效干预防治提供了新的线索和途径。