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目的:研究野蔷薇苷(Rosamultin)对EA.hy926内皮细胞缺氧损伤的保护作用,并探讨其可能机制。
方法:1、人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)用含10％FBS的高糖DMEM培养液置二氧化碳培养箱中培养,待细胞生长成单层后备用。2、通过MTT法及LDH检测确定EA.hy926内皮细胞的缺氧时间,建立缺氧损伤模型。3、通过MTT法及LDH检测确定野蔷薇苷高、中、低剂量组药物浓度,细胞随机分为正常对照组、缺氧损伤模型组、野蔷薇苷1×10-10mol/l、1×10-11mol/l、1×10-12mol/l干预组(缺氧同时加入野蔷薇苷),红景天苷组(1×10-5mol/l)。通过MTT法检测细胞代谢活力,检测LDH含量观察不同剂量野蔷薇苷对EA.hy926内皮细胞缺氧损伤的保护作用。4、采用HE染色观察野蔷薇苷对缺氧损伤EA.hy926细胞形态的影响。5、检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性及脂质氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量,研究野蔷薇苷对缺氧所致内皮细胞脂质过氧化损伤的保护作用。6、检测细胞外一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶(NOS)活性。7、通过RT-PCR、Western Blot以及ELISA技术检测各实验组HIF-1、VEGF mRNA及其蛋白表达的差异。
结果:1、倒置相差显微镜下观察,正常培养EA.hy926内皮细胞,呈上皮样贴壁生长,胞体饱满,折光良好,细胞成多角形或扁平短梭形,细胞核为圆形,椭圆形,可见核仁1～2个,呈鹅卵石样铺满底层。
2、缺氧损伤模型建立:EA.hy926细胞缺氧损伤0～2h,随缺氧时间的延长,细胞活性明显降低,LDH外漏增加,曲线较陡。2～6h间,随缺氧时间的延长,细胞活性下降幅度变小,LDH外漏量曲线趋于平缓,故确定2h为模型缺氧时间。
3、LDH活性检测及MTT法确定野蔷薇苷高、中、低剂量组药物浓度分别为1×10～10mol/l、l×10-11mol/l、1×10-12mol/l。
4、野蔷薇苷对EA.hy926内皮细胞缺氧损伤的保护作用:(1)MTT检测显示:与正常对照组比较,缺氧损伤模型组细胞代谢活力下降(P<0.01)；与缺氧损伤模型组比较,红景天苷及高、中、低剂量野蔷薇苷组均可提高缺氧EA.hy926内皮细胞代谢活力(P<0.01)。(2)HE巳染色:缺氧损伤模型组细胞胞体变小,核固缩,深染,部分细胞核肿大淡染,细胞间隙增大。红景天苷、野蔷薇苷各剂量干预组细胞形态、结构均明显改善。(3)细胞外LDH活性检测:与正常对照组比较,缺氧损伤模型组培养液中LDH活性显著升高(P<0.01)；与缺氧损伤模型组比较,红景天苷及野蔷薇苷各剂量组培养液LDH活性均显著降低(P<0.01)。
5、野蔷薇苷对EA.hy926内皮细胞缺氧损伤保护作用的机制探讨:(1)生化检测:与正常对照组比较,缺氧损伤模型组EA.hy926内皮细胞内SOD活性下降(P<0.01),MDA含量增加(P<0.01)；而红景天苷及野蔷薇苷各剂量组,与缺氧损伤模型组比较均可提高细胞内SOD活性(P<0.01),减少MDA的产生(高剂量P<0.01,中、低剂量P<0.05)。与正常对照组比较,缺氧损伤模型组细胞NO含量减少,NOS活性降低(P<0.01),而野蔷薇苷各剂量组和红景天苷组,与模型组比较NO含量、NOS活性均升高(P<0.01)。(2)RT-PCR实验结果显示,与正常对照组相比,模型组HIF-1α mRNA的表达量显著升高(P<0.01),VEGF mRNA的表达量无统计学差异；与模型组相比,各剂量野蔷薇苷组及红景天苷组HIF-1α的表达量显著下降(P<0.01),VEGF mRNA的表达量明显升高(P<0.01)。(3)Western Blot和ELISA实验结果显示,HIF-1α和VEGF蛋白表达水平与其mRNA检测结果相一致。
结论:野蔷薇苷对血管内皮细胞缺氧损伤具有显著的保护作用,提示其可能是蕨麻中具有抗缺氧功能的重要活性成分。其作用机制可能与抗氧自由基作用、促进NO的合成与释放、促进VEGF基因高表达有关。