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喜树碱(Camptothecin,CPT)是1958年从我国特有的树种-喜树(Camptotheca acuminata Decne)中分离得到的一种五环生物碱,作为独特的拓扑异构酶I(Topo I)抑制剂,CPT具有高效、广谱的抗肿瘤活性,但极差的水溶性、内酯环的不稳定性和极强的毒副作用限制了其临床应用。因而众多科研人员做了大量研究以提高其抗肿瘤作用、降低其毒副作用、增强其稳定性。胆酸是在肝脏中合成,储存于胆囊中的一大类胆烷酸,作为肝肠循环的一部分,每天在体内循环6-15次,并且肝细胞和肠细胞表面都有特异性的胆酸转运蛋白,分别是NTCP和ASBT。因而,胆酸是一类优良的天然配基,具有良好的生物相容性和强大的转运能力,与药物偶联后可能提高药物的口服生物利用度、增强药物的肝肠靶向性。由此,本课题组设计合成了一系列的CPT-胆酸偶联物,通过体外抗肿瘤活性筛选,发现化合物G2具有很强的抗肿瘤活性。同时,课题组关注到近几年有多篇文献报道Topo I抑制剂在炎症性疾病中起重要作用。因而,本课题在前期实验工作的基础上进一步开展了G2的肝靶向性、口服吸收、抗肿瘤作用机制和对脓毒症小鼠肝损伤的保护作用研究。(1)首先,依据课题组之前报道的方法,合成纯化制备得到化合物G2。利用胆酸转运蛋白(NTCP)阳性表达的肝癌细胞系HepG2的2D单层细胞模型和3D球体细胞模型,考察了脱氧胆酸对G2和CPT的细胞摄取和细胞毒性影响。结果表明经过脱氧胆酸预处理的HepG2细胞,G2对其细胞毒性被显著降低,CPT对其细胞毒性则不受影响。同样,在脱氧胆酸预处理的2D和3D HepG2细胞模型中,G2被细胞摄取的量呈浓度依赖性降低,而CPT被细胞摄取的量则不受脱氧胆酸预处理的影响。同时,在无脱氧胆酸预处理的2D和3D HepG2细胞模型中,G2被细胞摄取的量要明显高于CPT的摄取量。这些结果表明CPT-胆酸偶联物G2被HepG2细胞摄取过程可能借助了胆酸转运蛋白,因此在上述实验中G2表现出与脱氧胆酸的竞争摄取关系,同时证明G2具有通过细胞膜上的胆酸转运蛋白实现肝靶向性选择吸收的潜力。(2)利用小鼠动物模型,考察了G2和CPT在单次给药30 mg/Kg剂量下,在小鼠体内的组织分布情况,进一步计算化合物的肝靶向分布。与CPT相比,G2的肝靶向分布值提高1.67倍,表明CPT-胆酸偶联物G2在小鼠体内的组织分布也表现出一定的肝靶向性。(3)利用胆酸转运蛋白(ASBT)阳性表达的结肠癌细胞系Caco-2的2D单层细胞模型和3D球体细胞模型,考察了脱氧胆酸和Na~+对G2和CPT的细胞摄取和细胞毒性影响;并利用大鼠动物模型,考察了G2和CPT在单次给药30mg/Kg剂量下,在大鼠体内的血药动力学。结果表明经过脱氧胆酸预处理的Caco-2细胞,G2对其细胞毒性被显著降低,而CPT对其细胞毒性不受影响。同样,在脱氧胆酸预处理的3D Caco-2细胞模型中,G2的摄取的量呈浓度依赖性降低,而CPT的摄取的量则不受脱氧胆酸预处理的影响。而且,药物溶媒中Na~+的存在与否,能显著影响Caco-2的2D单层细胞对G2的摄取,但对CPT的摄取则没有影响。体内口服血药动力学研究结果表明,CPT-胆酸偶联物G2可显著改善大鼠体内口服吸收。(4)利用细胞和分子生物学手段,考察了G2对肝癌细胞HepG2和结肠癌细胞HCT116的细胞毒机制。MTT细胞毒性检测结果表明,G2对这两种细胞的毒性与CPT相当,且Topo I活性试验表明,G2对Topo I活性的抑制强于CPT。流式细胞仪检测结果进一步表明G2能呈浓度依赖性的诱导细胞凋亡,并将细胞周期阻滞在S期和G2/M期,G2显著诱导了细胞内ROS水平的提高和线粒体膜电位的降低,导致细胞内Caspase-3,-8,-9不同程度的激活,通过内源性和外源性两条细胞凋亡通路诱导细胞凋亡。qPCR和Western blot的结果表明,G2能上调bax、TNFα和p21的表达,下调Bcl-2的表达,从而诱导HepG2和HCT116细胞周期阻滞和细胞凋亡。(5)利用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立了小鼠脓毒症模型,并腹腔注射给予G2,考察了G2对脓毒症导致的肝损伤的影响。发现G2能明显的减轻CLP所导致的脓毒症的症状,并能降低脓毒症小鼠的死亡率。接着通过HE染色和ELISA检测血清中炎症因子水平,发现G2能减弱脓毒症导致的肝损伤和血清中炎症因子的增加。最后通过Western Blot检测小鼠肝脏组织中p-P65、P65、p-IκBα和IκBα的蛋白表达水平,发现G2能通过NF-κB途径达到对脓毒症肝损伤的保护作用。上述结果表明,脱氧胆酸作为配基连接到CPT分子上设计合成的G2与原药CPT相比,肝靶向和口服吸收的效果得到显著增强,且保持了较好的抗肿瘤活性;G2除了能应用于抗肿瘤领域的候选物开发,在严重炎症的治疗领域也可能发挥一定作用。