研究背景和目的作为青春期及育龄女性最常见的妇科内分泌疾病,多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)发病率3%-8%。其病因不详。PCOS不仅涉及生殖系统,而且是一个复杂的多系统综合征,相关的代谢失调包括胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)、高雄激素血症(high androgens, HA),糖代谢异常、脂代谢异常等。目前认为PCOS是一种表现为IR、代偿性高胰岛素血症、高雄激素血症、下丘脑—垂体—卵巢轴功能异常的常见慢性内分泌疾病。IR或高胰岛素血症、高雄激素血症和卵泡发育异常构成PCOS的主要病理特征。其中,IR是PCOS基础病理特征,促进高雄激素血症产生,又与HA,高促黄体激素(luteinizing hormoneLH)血症等相互作用,影响下丘脑—垂体—卵巢轴功能和卵泡发育异常。如何改善PCOS患者胰岛素抵抗,脂代谢紊乱,肥胖等代谢紊乱症状,目前并没有非常有效的治疗方法。疏肝、健脾、清热的经典方剂丹栀逍遥散(DanZhi XiaoYao Power, DZXYP)是《太平惠民和剂局方》逍遥散加丹皮、山栀而来,又名加味逍遥散。临床研究表明,丹栀逍遥散可以改善肝经郁热型PCOS患者临床症状和体征,有效率达77%和88.33%；同时,该药能够显著增强Ⅱ型糖尿病患者胰岛素敏感性而降低胰岛素抵抗水平。降低湿热内蕴型肥胖伴非酒精性脂肪性肝病患者体重指数,腰臀比,血脂,并且改善胰岛素抵抗,预防高血压,糖尿病。DZXYP是否可以治疗PCOS性激素紊乱,排卵障碍的同时,改善其代谢紊乱表现,目前尚无相关报道。其作用机制不清楚。我们拟建立PCOS大鼠模型,观察DZXYP改善PCOS大鼠代谢紊乱,性激素紊乱和卵泡发育异常的疗效。选用基于双向电泳的蛋白质组学技术研究分析PCOS发病机制及DZXYP的作用靶标,为DZXYP用于临床治疗PCOS提供依据,为深入研究PCOS发病机制及DZXYP作用机理奠定基础。方法1PCOS动物模型制备与分组给药采用随机数字表法将动物分为PCOS模型组(PCOS组)、PCOS十达英35组(PCOS+Diane-35组)、PCOS+丹栀逍遥散组(PCOS+DZXYP)组和正常对照组(Control组),每组10只。皮下埋植左旋18-甲基炔诺酮硅胶棒和皮下注射hCG制造PCOS模型；35日龄开始,灌胃方式给药。实验开始及结束分别称重并计算体重差(body weight gain difference, BWGD),实验结束时,左心室采血5mL,-80℃保存备用；分离卵巢记录卵巢重量(ovary weight, OW);取卵巢组织用于病理切片观察和其他检测。2组织学检查卵巢组织常规脱水、透明、浸蜡、包埋,5μm切片,常规苏木精-伊红(hemotoxylin and eosin, HE)染色,显微镜分析图像,进行组织病理学检查。3检测血糖、血脂、E2、T和胰岛素生化分析仪检测各组大鼠的甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)和空腹血糖(fasting blood glucos,FBG)。血清睾酮(testosterone, T),雌二醇(estradiol, E2)和空腹胰岛素水平(fasting insulin, FINS)用西门子ADVIA Centaur XP全自动免疫分析系统及其化学发光配套试剂进行检测。4蛋白液相芯片检测FSH和LH选用Rat Pituitary Magnetic Bead Panel (RPTMAG-86K)试剂盒,在LiquiChip液相芯片检测系统上读取各孔荧光强度,并根据标准品的荧光强度得到样品的FSH和LH浓度。5双向电泳、质谱鉴定及分析DZXYP调控PCOS大鼠的差异蛋白双向电泳参照IPGPhorⅢ等电聚焦系统程序指南和IPGstrip使用说明书进行操作,硝酸银染色后所得凝胶经对比找出差异蛋白,应用Voyager DE STR MALDI-TOF-MS(ABI)进行鉴定,获取肽质量指纹谱。利用软件mascot distiller过滤基线峰,识别信号峰。利用MOlecular Weight Search (MOWSE)寻找匹配的相关蛋白质,查询其功能。6免疫组织化学技术检测大鼠β-arrestin2, PCNA蛋白表达按免疫组化常规步骤进行,使用安装了图像分析系统(Image Pro Plus5.0Media Cybernetics, USA)的光学显微镜来检测阳性区域的光密度确定免疫组化染色的程度,按链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术试剂盒说明书操作,检测β-抑制蛋白2(β-arrestin2,3-arr2)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)分布表达。7Western blot检测β-arrestin2蛋白在大鼠卵巢的表达按本实验室常规操作步骤进行,在KODAK Image Station4000MM Digital Imaging System中(kodak,版本4.0)曝光成像。图像用Molecular Imaging Software Version4.0(Kodak)进行蛋白条带灰度分析。每个样本的蛋白水平用β-actin作为内参进行标准化。每组样品重复上样检测3次。8RQ-PCR检测β-arrestin2mRNA在大鼠卵巢的表达按本实验室RQ-PCR常规操作步骤进行,每个引物(序列信息)的相对定量由标准曲线测定。mRNA的量由内参照β-actin标准化。相对表达量通过2-△△Ct法获取。9Western blot检测P450arom,细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2, ERK1/2)、胰岛素受体底物1(insul in receptor substrate1, IRS-1)、Akt及其磷酸化蛋白在DZXYP干预的PCOS大鼠卵巢的表达按本实验室常规操作步骤进行,在KODAK Image Station4000MM Digital Imaging System中(kodak,版本4.0),曝光成像。图像用Molecular Imaging Software Version4.0(Kodak)进行蛋白条带灰度分析。检测DZXYP对P450arom。ERK1/2和p-ERK1/2、IRS-1和p-IRS-1、Akt和p-Akt蛋白在PCOS大鼠中表达的调控。10统计学分析数据用X±s表示。采用SPSS13.0软件包进行统计分析,首先对数据进行方差齐性检验,方差齐则应用ANOVA法进行检验,并用LSD法进行组间两两比较；如果方差不齐,则应用Welch法进行检验,应用Games Howe11法进行两两比较；计量资料用多个独立样本非参数检验,两组间比较用2独立样本非参数检验；P<0.05为差异有统计学意义。结果PCOS模型及DZXYP作用效果鉴定1. DZXYP对PCOS大鼠卵巢重量和组织学影响1.1DZXYP对PCOS大鼠卵巢重量(OW)影响PCOS组大鼠OW显著高于对照组(P=0.000)。和PCOS组比较,Diane-35组和DZXYP组OW显著减少,差异有统计学意义(P=0.000和P=0.000)。DZXYP组和Diane-35组比较OW更轻,差异有统计学意义(P=0.014)。1.2DZXYP对PCOS大鼠卵巢组织学影响PCOS组大鼠卵巢组织结构紊乱,囊性扩张卵泡数目明显增多,颗粒细胞层数减少,排列松散。对照组可见不同发育阶段的卵泡及多个黄体,颗粒细胞较完整,排列整齐。DZXYP组卵泡扩张显著改善,可见接近正常的窦状卵泡,颗粒细胞排列较为整齐。Diane-35组卵巢有较大囊性扩张卵泡,颗粒细胞层较PCOS稍多,但排列松散。1.3. DZXYP对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞PCNA表达影响PCOS组颗粒细胞层数明显减少,多为2-3层,排列疏松。对照组颗粒细胞较完整,排列整齐,多为8-9层。DZXYP组卵泡扩张显著改善,颗粒细胞排列较为整齐,PCNA标记颗粒细胞多为4-6层。达英-35组正常窦状卵泡结构仍然很少见,但颗粒细胞层较PCOS组稍多,约3-4层。2. DZXYP对血清生殖激素水平的影响和对照组比较,PCOS大鼠血清LH和T在实验末期显著升高(P=0.001和P=0.045),FSH水平显著降低(P=0.000),LH/FSH显著升高(P=0.007)。各处理组间E：没有显著性差异DZXYP使PCOS大鼠血清FSH水平显著增加,LH水平显著降低,LH/FSH降低,差异有统计学意义(P=0.004,P=0.041,P=0.036)。DZXYP显著降低T水平(P=0.002)。Diane-35使PCOS大鼠血清FSH水平显著增加(P=0.029)。对LH、LH/FS和T水平无明显影响(P=0.614,P=0.086和P=0.299)。3. DZXYP对PCOS大鼠血脂四项的影响和正常对照组相比,PCOS组大鼠实验末期TG、TC、LDL水平显著升高,HDL水平显著降低,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.002,P=0.000,P=0.002)。DXZYP显著降低PCOS大鼠血清TG、TC、LDL水平,升高HDL水平,差异有统计学意义((P=0.000,P=0.023,P=0.000和0.049)。Diane-35降低PCOS大鼠TG水平(P=0.005),升高HDL水平(P=0.016),差异有统计学意义,对TG、TC和LDL无显著性作用。4. DZXYP对PCOS大鼠IR的影响PCOS大鼠血清FBG、FINS和HOMA在实验末期显著增高(P=0.000,P=0.002,P=0.000)。与模型组相比,DZXYP显著降低INS(P=0.035)和HOMA (P=0.007)水平,对FBG无显著影响(P=0.099)。Diane-35组PCOS大鼠FBG.FINS和HOMA-IR水平没有显著改善(P=0.252,P=0.242,P=0.088)。5. DZXYP对PCOS大鼠体重差的影响和对照组比较,PCOS大鼠BWGD显著增加(P=0.003)。DZXYP组BWGD显著减少(P=0.013),而使用Diane-35后,PCOS大鼠的BWGD没有显著变化(P=0.096)。DZXYP防治PCOS的蛋白质组学研究6.双向电泳检测及质谱鉴定DZXYP干预PCOS大鼠的差异蛋白PCOS组和PCOS±DZXYP组分别与对照组对比,进行质谱分析。成功鉴定8个差异蛋白点。其中4个表达水平下调,4个表达水平上调。其中3个分别被鉴定为过氧化氧化还原蛋白3(peroxiredoxin3, PRDX3)和谷胱甘肽过氧化酶1(glutathione peroxidase1, GPX1)。7.分析DZXXP对PCOS大鼠β-arr2表达的影响7.1免疫组化分析DZXXP对PCOS大鼠卵巢β-arr2表达的影响PCOS组β-arr2表达较对照组显著降低(P=0.000),与PCOS组相比,DZXYP和Diane-35显著增加其表达(P=0.000和P=0.018),和Diane-35比较,DZXYP的作用更明显,表达的差异有统计学意义(P=0.003)。7.2Western blot分析DZXYP对PCOS大鼠卵巢β-arr-2表达影响与对照组相比,PCOS组β-arrestin2表达显著降低(P=0.000),DZXYP和Diane-35处理后β-arr2蛋白水平表达增加(P=0.000和P=0.022)。而DZXYP对该蛋白水平表达的影响较Diane-35更显著,差异有统计学意义(P=0.000)。7.3RQ-PCR检测DZXXP对PCOS大鼠卵巢β-arr2表达的影响对照组相比,PCOS组β-arrestin2表达显著降低(P=0.000),DZXYP处理后β-arr2的mRNA表达增加(P=0.000)。PCOS大鼠经Diane-35处理后β-arr2mRNA表达无显著性变化(P=0.057)。β-arrestin2介导的信号通路在DZXYP防治PCOS中的作用8. Westerm blot方法检测DZXYP对P450arom和ERK1/2磷酸化的影响PCOS大鼠P450arom表达较对照组显著下降,ERK1/2磷酸化增加,差异有统计学意义(P=0.000和P=0.000),DZXYP显著增加P450arom表达,显著降低ERK1/2磷酸化水平,差异有统计学意义(P=0.005和P=0.000)。虽然Diane-35也显著降低ERK1/2磷酸化水平(P=0.001),但是DZXYP的作用较Diane-35更明显,差异有统计学意义(P=0.038)。Diane-35对P450arom表达没有显著作用(P=0.831)。9. Westerm blot方法检测DZXYP对IRS-1丝氨酸和AKT ser473磷酸化影响和对照组比较,PCOS大鼠p-IRS-1表达增加,p-AKT ser473表达下降,差异有统计学意义(P=0.000和P=0.000),DZXYP显著降低PCOS大鼠卵巢IRS-1的磷酸化水平,显著增加AKT ser473的磷酸化水平,差异有统计学意义(P0.004和P=0.009)。Diane-35显著增加AKT ser473的磷酸化水平,差异有统计学意义(P=0.024),对IRS-1丝氨酸磷酸化没有显著影响(P=0.078)。结论1.DZXYP有效改善大鼠PCOS症状：改善IR,脂代谢紊乱、体重增加等代谢紊乱症状。改善高LH水平和HA。减轻卵巢重量,有效改善PCOS大鼠卵泡发育异常。2. DZXYP作用机制涉及以下几方面：①DZXYP可能通过β-arr2促进G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors, GPCRs)与G蛋白解偶联,中止LH/CG受体(LH receptor, LHR)信号转导,恢复其受体脱敏作用；②DZXYP通过β-arr2信号通路减少ERK1/2磷酸化,进而增加芳香化酶450水平；③通过增加β-arr2表达,作为支架蛋白,与IR下游信号分子形成InsR/Akt/β-arr2/Src蛋白复合物,激活PI3-K通路,磷酸化AKT473-9氨酸,从而发挥胰岛素增敏的作用。④另外,DZXYP降低IRS-1Ser307磷酸化水平,增加AKT磷酸化,改善胰岛素抵抗。