【摘 要】
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叶表皮毛除了对白菜的生理特征和抗逆性具有重要影响,同时也是白菜外观品质的重要组成之一。GL1（GLABRA1）属于MYB家族转录因子,在表皮毛起始发育过程中发挥重要的功能。本实验室前期利用无毛自交系14XS23-20和其有毛突变体14XS23-73对叶表皮毛性状进行了基因精细定位和候选基因分析,推测定位区间GL1为候选基因。在前期研究的基础上,本研究克隆了GL1基因及其启动子序列,运用生物信息学方
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叶表皮毛除了对白菜的生理特征和抗逆性具有重要影响,同时也是白菜外观品质的重要组成之一。GL1（GLABRA1）属于MYB家族转录因子,在表皮毛起始发育过程中发挥重要的功能。本实验室前期利用无毛自交系14XS23-20和其有毛突变体14XS23-73对叶表皮毛性状进行了基因精细定位和候选基因分析,推测定位区间GL1为候选基因。在前期研究的基础上,本研究克隆了GL1基因及其启动子序列,运用生物信息学方法对获得基因进行了全面分析。研究该基因及叶毛调控网络关键基因的组织表达特性,构建了35S::BrGL1::EGFP表达载体,分析了GL1亚细胞定位;构建了BrGL1pro::BrGL1::EGFP表达载体;构建了BrGL1pro::GUS表达载体,并通过烟草瞬时转化检测其表达特性,主要研究结果如下:1.以无毛自交系14XS23-20和其有毛突变体14XS23-73为材料,克隆获得了2个材料的DNA片段,2个片段包含ORF区的长度分别为1567bp与1565bp,序列相似性达98.29%。2个片段均由2个内含子3个外显子组成,在第三外显子上无毛14XS23-20的序列比有毛14XS23-73少了5bp,还有一个G到T的点突变,其他的突变位点都发生在内含子区。克隆得到了14XS23-73的c DNA序列长度为678bp,编码225个氨基酸。生物信息学分析显示,该蛋白是定位于细胞核的非分泌蛋白,没有跨膜区且不具有信号识别功能,稳定性较低,亲水性较强。系统发育树结果表明该基因编码的氨基酸序列与大白菜和甘蓝型油菜的GL1序列相似性达96%以上,与十字花科作物亲缘关系较近。2.qRT-PCR技术分析GL1基因及表皮毛调控网络关键基因表达特性。结果显示,在有毛材料中正调控因子GL1、GL2、GL3、TTG1-2均上调,TTG1-1、EGL3-1、EGL3-2表达下调;负调控因子ETC1、ETC3-1、ETC3-2、PDF2-3、CPC-1、CPC-2表达上调,ETC3-3表达下调,TRY、PDF2-1两个表达差异不明显。除了TTG1-1在各组织中表达量较平均,其他基因都主要在生长点及幼叶中表达,根和叶柄中表达量普遍较低,表达模式具有组织特异性。与模式植物拟南芥有所不同的是大量负调控因子在有毛材料中表达出现上调。3.以有毛突变体14XS23-73的DNA为模板,克隆到了BrGL1基因编码序列上游1243bp的启动子序列。启动子元件分析结果显示,BrGL1启动子区域具有真核生物启动子所必须的基本顺式作用调控元件CAAT-box和TATA-box,说明该启动子是由RNA聚合酶Ⅱ结合的启动子。除此之外,还具有光、植物激素、逆境、生物钟以及组织特异性等顺式作用调控元件,如ACA-motif、ERE、TCA-element、HSE、circadian、CCGTCC-box等,推测BrGL1基因的表达可能受到光周期、乙烯与水杨酸、热胁迫以及组织特异性的影响。4.在BrGL1基因及启动子克隆的基础上,分别成功构建了3个表达载体。构建了35S::BrGL1::EGFP过表达载体,通过检测GFP荧光蛋白在烟草表皮细胞的瞬时表达,发现BrGL1基因定位于细胞核,该结果与用在线数据库预测的结果相同,推测其为核蛋白;构建了BrGL1pro::BrGL1::EGFP表达载体;构建了BrGL1pro::GUS表达载体,通过烟草瞬时转化,证明BrGL1启动子可以在植物组织中正常启动GUS基因的表达。
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