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背景炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(crohn’s disease,CD)两种疾病形式,是一组原因不明的慢性消化道非特异性疾病。炎性细胞因子、蛋白水解酶等介质参与该疾病组织损伤和黏膜愈合过程,而肠道黏膜修复与愈合与IBD特别是UC的并发症、住院率、预后关系密切。基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP-7)作为蛋白水解酶的一种,参与细胞外基质重塑、异常免疫调控、黏膜愈合、肿瘤侵袭等过程,但MMP-7在UC结肠异常免疫反应中的作用仍不清楚。研究发现,过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)的配体依赖性激活下调肿瘤环境及葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导小鼠结肠炎组织MMP-7生成。然而UC发病过程中主要的炎性介质如白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)及肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)是否影响MMP-7的表达以及MMP-7过表达是否影响黏膜愈合相关细胞因子水平,进而影响UC的黏膜修复与愈合过程,仍需进一步探究。目的本实验通过验证UC患者结肠组织中MMP-7的表达水平与定位,初步了解MMP-7与UC炎症程度之间的关系;通过构建模拟肠道上皮屏障的Caco-2单层细胞模型,经炎性细胞因子干预后检测MMP-7 mRNA以及ZO-1、Occludin、MLCK、p-MLC的表达,了解炎性细胞因子与MMP-7水平和黏膜屏障分子之间的关系;通过过表达MMP-7基因,检测该细胞因子是否影响黏膜屏障愈合相关蛋白表达,进而为UC的诊断和预后提供依据。方法1.病人组织标本的收集:收集2018年5月-2019年10月入院或门诊治疗的UC患者组织标本共33例,其中轻度7例,中度14例,重度12例,另收集20例同期收住院的结肠癌癌旁术中切除无癌细胞浸润(均距癌旁超过5 cm)组织标本,并经过专业的病理医生证实,上述患者近1月来未接受糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂等药物治疗。2.选取对数期生长的Caco-2细胞株,以4×105个/ml细胞接种于12孔Transwell小室内构建肠道上皮屏障模型,检测各10 ng/ml的IL-1β及TNF-α炎性因子混合物干预48 h、药物干预组另加入罗格列酮10 μmol/L干预48 h后TEER相对数值变化水平。3.收集不少于1×107个细胞,按照上述处理方式处理48 h后,荧光定量PCR或者 Western Blot 检测 MMP-7、ZO-1、Occludin、MLCK 和 p-MLC 等 mRNA或者蛋白的表达水平。4.以4×104/孔细胞数接种于24孔板中,按照上述干预条件,激光共聚焦显微镜下观察紧密连接蛋白ZO-1、Occludin细胞免疫荧光定位表达。5.构建MMP-7过表达稳转细胞系,Western Blot检测MMP-7过表达Caco-2细胞中黏膜愈合相关蛋白SDC-1的表达。6.采用spss 24.0软件分析处理数据,计数分析资料采用平均值±标准差描述表示,组间构成比采用χ2检验,各组数据经方差齐性或正态检验后,两组或多组比较采用独立样本t检验或秩和检验,检验标准α=0.05,P<0.05差异具有统计学意义。结果1.UC患者结肠组织苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色UC患者结肠组织上皮细胞有不同程度的破坏,并伴有肠道组织黏膜层及黏膜下层,甚至固有层腺体结构的消失,炎性细胞不同程度的浸润,隐窝结构融合、变形、消失等,光镜下可见黏膜层以及黏膜下层大量炎性细胞浸润,并与UC病情程度密切相关。2.UC患者结肠组织MMP-7的表达阴性对照组和轻度UC组可见极少量的MMP-7阳性细胞,染色强度较弱;而中重度UC组结肠组织可见大量染色呈棕黄色或者深黄色的阳性区域,主要集中于损伤的肠道溃疡组织边缘上皮细胞中,且部分炎性细胞也发现MMP-7的阳性表达与定位。中重度UC结肠组织MMP-7表达的积分较对照组、轻度UC组水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05),但阴性对照组与轻度UC组相比无统计学差异(P>.05)。3.Caco-2细胞单层上皮细胞屏障通透性变化不同组别在不同时间段(12、24、48 h)之间的TEER相对比值分析发现,炎性因子组相对比值依次为(0.613±0.015、0.507±0.021、0.457±0.015),罗格列酮组的相对比值为(0.800±0.026、0.660±0.026、0.600±0.020),阴性对照组 TEER相对比值随时间变化不大,但炎性因子组TEER相对比值降低幅度较大,而罗格列酮组的相对比值变化则介于两者之间。4.荧光定量 PCR 检测 MMP-7、ZO-1、OccludinmRNA 表达;炎性细胞因子组MMP-7 mRNA的相对表达量数值高于阴性对照组和罗格列酮干预组,差异具有统计学意义(P<0.05);但炎性因子组紧密连接蛋白ZO-1、Occludin mRNA低于阴性对照组和罗格列酮干预组,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.紧密连接蛋白ZO-1和Occludin细胞免疫荧光定位变化激光共聚焦显微镜下可见ZO-1、Occludin激发光均为红光;阴性对照组下ZO-1、Occludin蛋白荧光沿细胞膜分布,并清晰可见,荧光较强,边缘光滑,勾勒出内皮细胞铺路石轮廓,细胞之间连接紧密。炎性细胞组紧密连接蛋白荧光强度较弱,细胞之间连接可有断裂、裂隙等。罗格列酮组可见细胞连接荧光强度、完整性、轮廓、荧光信号均较炎性因子组清晰,但仍低于阴性对照组。6.Western Blot 检测 MLCK、p-MLC 蛋白的表达炎性细胞因子组MLCK、p-MLC蛋白表达较阴性对照组及罗格列酮处理组水平均较高,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.MMP-7与肠道黏膜愈合相关蛋白的表达Western Blot结果显示阴性对照组SDC-1表达相对值较MMP-7过表达Caco-2细胞组水平较高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.UC患者结肠组织MMP-7表达增强。2.炎性细胞因子IL-1β及TNF-α促进MMP-7的表达、破坏肠道紧密连接蛋白,激活MLCK/p-MLC信号分子通路。3.MMP-7的黏膜破坏作用与SDC-1降低有关。