论文部分内容阅读
目的：电压-门控质子通道，即 Hv1，对质子具有高度选择性，对 NADPH氧化酶依赖的活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生是非常必要的，在中枢神经系统特异性和功能性表达在小胶质细胞。而小胶质细胞作为中枢神经系统的免疫细胞，其M1, M2分型对白质的损伤，再生，修复具有非常重要的作用。M1型小胶质细胞大量产生ROS,而Hv1-/-小胶质细胞ROS大量减少，那么Hv1-/-对小胶质细胞的分型是否有影响，是否能够对白质损伤有保护性作用呢？ 方法：用双侧颈总动脉狭窄（bilateral common carotid artery stenosis, BCAS）建立慢性低灌注脑白质损伤所致血管性认知功能障碍小鼠模型。免疫荧光检测髓鞘碱性蛋白MBP,髓鞘糖蛋白 MAG,去磷酸化神经丝 Smi32，神经丝重链蛋白 NF200,在小鼠BCAS模型后表达量的改变。免疫荧光双标少突胶质细胞上的Nfasc155和轴突上的caspr蛋白观察朗飞节侧区隔板样结构；荧光双标Nav1.6和caspr观察朗飞节区Nav1.6通道长度的改变。免疫荧光双标CD16/32和Iba1计数野生型（wild type,WT）和Hv1-/-型小鼠Sham组及BCAS组M1型小胶质细胞数目；免疫荧光双标CD206和Iba1计数上述分组 M2型小胶质细胞数目。体外培养 WT和 Hv1-/-小鼠的小胶质细胞，用LPS+IFNγ或者IL-4诱导细胞转化为M1型或者M2型，qPCR检测CD16/32, iNOS, TNFα; CD206, Arg1，CCL22等指标mRNA表达变化，Western Blot技术检测iNOS, CD16/32, CD206, Arg1蛋白表达变化。八臂迷宫检测小鼠行为学的改变。 结果：在模型组Nfasc155和caspr共定位系数降低，MAG表达明显减少，说明BCAS术后出现轴突胶质微结构的破坏；Smi32表达升高，而NF表达无明显变化，说明胼胝体中轴突纤维出现去磷酸化，轻微受损；BCAS模型后，与 Sham组相比，Hv1-/-组共定位系数较高，MAG蛋白表达也多，Smi32表达减少，说明Hv1敲除对慢性低灌注导致的损伤有保护性作用；八臂迷宫行为学显示H v1-/-模型组小鼠认知能力明显好于WT模型组；BCAS模型后，通过胼胝体的CD16/32与Iba1双标显示Hv1-/-组的M1型小胶质细胞数量明显少于WT组，而CD206与Iba1双标显示Hv1-/-组的M2型小胶质细胞数量明显多于 WT组；体外小胶质细胞培养诱导成 M1, M2型，检测mRNA表达水平及WB检测蛋白表达结果显示相对WT组，Hv1-/-小胶质细胞CD16/32,iNOS等M1标志物表达水平下降，CD206, Arg1等M2标志物表达水平升高；体内外的结果显示Hv1基因敲除有助于小胶质细胞从M1型向M2型转化，从而实现对BCAS模型中脱髓鞘病理改变的保护作用。 结论：相较于野生型C57模型组小鼠，Hv1-/-模型组小鼠在分子细胞水平和行为学水平均显示出对白质损伤的保护作用。一系列体内外实验证实H v1-/-有助于小胶质细胞从M1型向M2型转化，可能介导了Hv1-/-对BCAS后的白质保护作用。Hv1为潜在的缺血性脑白质损伤治疗靶点。