花榈木(Ormosia henryi Prain)为蝶形花科Papilionaceae红豆属Ormosia的珍贵用材、园林绿化树种,具有较高的经济价值。花榈木能与根瘤菌共生形成根瘤,但与哪些根瘤菌共生?其特性是什么?是否具有表型多样性和遗传多样性?人工接种根瘤菌后有哪些接种效应?尚不清楚。这些问题的解决对研究花榈木-根瘤菌共生固氮体系,丰富我国根瘤菌基因资源,选育高效菌株进行人工接种以提高花榈木苗木质量具有十分重要的意义。针对这些问题,研究小组在花榈木分布区广泛采集花榈木根瘤,进行野生分布特征和生境调查,分析花榈木-根瘤菌多样性与环境的耦合关系;运用传统培养方法和高通量测序技术,探索根瘤细菌的组成和分布;对花榈木根瘤菌进行分离纯化和回接验证,通过生理生化测定和分子生物学手段分析根瘤菌表型多样性和遗传多样性,以明确花榈木根瘤菌的系统发育地位,并进行人工接种根瘤菌和接种苗抗旱试验,筛选优良促生和抗旱菌株。通过4年多的研究,得出如下主要结论:(1)花榈木根瘤主要集中分布在0-30cm的土层内,10-20cm土层根瘤数量、重量最大,根瘤主要着生在花榈木侧根上,其形状有球形、椭圆形、长条形、棒状分叉、姜状和珊瑚状等,根瘤小的仅1-2mm,大的可达20mm以上。根瘤的颜色有浅黄色、黄褐色、浅褐色、深褐色等,属于无限根瘤类型。花榈木根瘤菌菌落生长时间为2-7d,直径达1.5-6mm,乳脂色或半透明,边缘整齐,表面凸起,产生粘液,具光泽,不吸收刚果红,革兰氏染色为阴性,根瘤菌呈杆状、棒槌状,部分呈X、T形,平均大小为3.12±0.70μm×0.69±0.08μm。(2)生态环境对根瘤菌与花榈木共生关系的影响较大,海拔对根瘤重具有极显著的作用,海拔越低,根瘤越重;土壤pH对花榈木根瘤大小的影响最大,在pH为3.76-6.89的范围内,根瘤短径随pH的增加而增大;根瘤重与碱解氮含量最相关,土壤碱解氮含量越高,单个根瘤越重。在花榈木根瘤内细菌的物种分布上,土壤因子比地理因子的影响大,一定范围内,花榈木根瘤内细菌的多样性随土壤速效钾含量的增加而增加。(3)花榈木根瘤内细菌具有丰富的多样性,可以注释到6门、11纲、20目、34科,61属。包括结瘤共生菌和非结瘤共生菌,分别为Proteobacteria(变形菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Spirochaetes(螺旋体门)、Melainabacteria,其中Proteobacteria(变形菌门)包含了大部分结瘤共生菌,和Firmicutes(厚壁菌门)一起构成花榈木根瘤细菌的优势门。(4)花榈木根瘤菌的表型多样性丰富,大部分菌株对碳水化合物利用能力比较广泛,少数菌株对碳源利用能力较差,所有供试菌株均可利用L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-白氨酸、L-谷氨酸作为唯一氮源。对头孢霉素的抗性最弱,对溶解酶素的抗性最强。供试菌株普遍具有较强的耐酸能力,而耐碱能力较差,大部分花榈木根瘤菌菌株能在4-40℃温度中生长,少部分菌株能在60℃中生存,总体对温度的适应性范围较广。多数花榈木菌株在无NaCl、1%NaCl、2%NaCl生长较好,随着NaCl浓度的增加,花榈木根瘤菌生长越来越差。68.4%的菌株BTB中产酸,31.6%的菌株BTB中产碱。所有供试菌株不产生氧化酶,98.2%的菌株能产生过氧化氢酶,96.5%的菌株不能在肉汤中生长。57株供试菌株在82%相似性水平可以分为5个表观群。(5)花榈木根瘤菌16S rRNA扩增产物分别用四种限制性内切酶(Hae III、Hinf I、MspI和RsaI)酶切后,分别得到22、21、21、15种限制性内切酶酶切图谱类型和50种组合类型,表现出了较高的遗传多样性。供试菌株16S r RNA PCR-RFLP、BOX-PCR指纹图谱分别在75%、70%的相似性水平上分为6大类,这些遗传图谱类型分布没有明显的地域性特点。16S rRNA PCR-RFLP、BOX-PCR指纹图谱及16S rRNA基因的全序列三个聚类树状图揭示的发育关系具有较好的一致性,57株可结瘤菌株分别位于Rhizobium(根瘤菌属)、Azorhizobiu(固氮根瘤菌属)、Mesorhizobium(中慢生根瘤菌属)、Bradyrhizobium(慢生根瘤菌属)、Sinorhizobium(中华根瘤菌属)、Burkholderia(伯克氏菌属)6个属中。(6)接种根瘤菌能显著提高花榈木幼苗叶片的光合速率、蒸腾速率、叶绿素荧光参数,促进花榈木幼苗的地上地下部分生长及总生物量积累。不同菌株的促生效果存在显著差异,通过促生效应综合评价,排名前五的菌株依次为45号、46号、32号、51号、47号,可初步作为优良促生菌株。(7)接种根瘤菌能显著提高花榈木幼苗的抗旱性,花榈木接种不同的菌株对中度干旱胁迫的生理响应差异显著。接种根瘤菌能够降低干旱胁迫对花榈木叶片质膜相对透性的影响,提高植株体内脯氨酸及可溶性糖等可渗透调节物质含量以及提高活性氧和自由基清除酶SOD的活性,从而减小对细胞造成的脱水伤害,并能有效减少膜脂过氧化产物MDA的积累,提高花榈木幼苗的耐旱能力。接种后花榈木幼苗光合速率、水分利用效率、PSⅡ反应中心内的光能转化效率和PSⅡ的潜在活性提高,对干旱胁迫的调节适应能力增强。抗旱综合评价结果显示,34号、35号、32号、43号、28号、37号菌株有利于提高花榈木幼苗的抗旱性,可初步作为优良的抗旱菌株。综合促生效果和抗旱性指标,得到38号、35号、42号、47号、32号菌株为既促生和抗旱综合效果最佳的前五名菌株。