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1、骨髓来源间充质干细胞的提取、培养与扩增目的：优化获取兔骨髓间充质干细胞方法,并对细胞进行纯化、鉴定及扩增,同时对其生物学性状进行研究。方法：取新生新西兰大耳白兔骨髓5.0ml,采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对其进行纯化,观察细胞形态和表面标志物的表达,从而对其进行鉴定。观察第1、3、5、7代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线。结果：经密度梯度离心、贴壁筛选并结合细胞传代均可得到贴壁细胞集落,密度梯度离心集落形成率稍高,但贴壁筛选法操作更简便。传代至第3代和第5代细胞形态单一,细胞排列具有典型的漩涡状结构。第1、3、5代细胞增殖能力强,生长旺盛；至第7代细胞增殖明显减弱。所分离培养的细胞表达CD44、CD90,不表达CD34。结论：分离培养的细胞为间充质干细胞,且成份单一,具有多向分化潜能,且无造血系干细胞标志。经体外传代,增殖能力强,适宜作为种子细胞进行下一步研究。2、外源性透明质酸对MSCs增殖及分化情况的影响目的：通过研究外源性透明质酸(hyaluronic acid, HA)对兔骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, Mscs)体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对Mscs的作用,为Mscs为基础的组织工程化软骨的临床应用奠定基础。方法：全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔Mscs,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入HA诱导液(含0.25mg/ml HA+含10%FBS的HG-DMEM),以TGF-β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7、14、21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果：经HA诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结论：外源性HA具有诱导兔Mscs向软骨细胞分化的能力,但比TGF-β3的诱导能力弱。提示关节腔内环境对Mscs向软骨细胞分化有正性促进作用,支持HA作为软骨组织工程基质使用。3、不同浓度透明质酸对骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响目的：探讨不同浓度透明质酸对骨髓来源间充质干细胞向软骨方向定向分化的影响。方法：取P3代未诱导的骨髓来源间充质干细胞,按培养液中添加的透明质酸浓度不同分为两实验组,A组：低浓度组(基础培养基+HA0.1mg/m1),B组：高浓度组(基础培养基+HA0.2mg/m1)。同时设立空白对照组(基础培养基)及阳性对照组(基础培养基+10ng/ml TGF-β3),观察细胞形态,增殖情况并绘制生长曲线,分别于诱导后第7、14、21d行免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果：经添加软骨诱导剂后,干细胞细胞增殖速度放缓,形态由长梭形变为多角形、椭圆形,胞浆Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,半定量分析显示两实验组Ⅱ型胶原表达无差异,但均比阳性对照组弱,空白对照组无Ⅱ型胶原表达。结论：不同浓度外源性HA诱导兔Mscs向软骨细胞分化的能力无差异,且均比TGF-β3的诱导能力弱。提示HA作为细胞外基质的主要成分,有促进Mscs向软骨细胞分化的作用,但改变外环境中透明质酸浓度不会影响Mscs的软骨分化。自体关节腔内环境支持以干细胞为基础的组织工程化软骨修复软骨缺损。4、不同分-子-量透明质酸对骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响目的：探讨不同分子量透明质酸对骨髓来源间充质干细胞向软骨方向定向分化的影响。方法：取P3代未诱导的骨髓来源间充质干细胞,培养液中分别添加不同分子量透明质酸做诱导剂,分为三个实验组,A组：低分子量组(基础培养基+HA0.1mg/ml,平均分子量约1000kD),B组：中分子量组(基础培养基+HA0.1mg/ml,平均分子量约1800kD),高分子量组(基础培养基+HA0.1mg/m1,平均分子量约2000kD)。同时设立空白对照组(基础培养基)及阳性对照组(基础培养基+10ng/ml TGF-β3),观察细胞形态,增殖情况并绘制生长曲线,分别于诱导后第7、14、21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,另外采用免疫组化染色及RT-PCR方法检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果：经添加软骨诱导剂后,干细胞细胞增殖速度放缓,形态由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性,胞浆Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,半定量分析显示实验组Ⅱ型胶原表达与对照组有差异,但B、C组间Ⅱ型胶原表达相似,空白对照组无Ⅱ型胶原表达。结论：不同分子量外源性HA诱导兔Mscs向软骨细胞分化的能力存在差异,分子量高的HA的诱导能力较低分子量HA的诱导能力强。证明透明质酸的分子量与Mscs的软骨分化有关联性,但均比TGF-β3的诱导能力弱。提高关节腔内透明质酸分子量对干细胞为基础的组织工程化软骨修复软骨缺损有帮助。5、外源性透明质酸诱导骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨缺损的研究目的：探讨外源性透明质酸(hyaluronic acid, HA)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)对全层软骨缺损修复的效果,了解体内条件下经外源性透明质酸诱导的干细胞能否保持软骨分化表型,促进软骨修复。方法：4月龄日本大耳白兔24只,用手摇钻制成直径5mm、深4mm的圆柱形膝关节软骨缺损。分四组分别植入藻酸盐凝胶混合的经透明质酸诱导后兔骨髓间充质干细胞(组A,n=6),藻酸盐凝胶混合的未经诱导的兔骨髓间充质干细胞(组B,n=6),单纯藻酸盐凝胶组(组C,n=6),及缺损处不处理(组D,n=6)。术后5、8和12周观察软骨缺损修复情况,进行组织学评分。HE染色观察软骨细胞情况,RT-PCR检测修复组织中Ⅱ型胶原mRNA合成情况。结果：术后第8周,A组及B组与其他组比较,缺损处软骨充填较好,与正常软骨结合紧密,融合良好,组织学评分有差异,但A组与B组间评分无差异。至第12周,可见A组及B组关节面平滑,结合紧密,与周围软骨结合良好,移植物界限基本消失。大体评分A组、B组均优于其他组,且A组与B组间差异有显著性。组织学观察显示,修复组织A组类似透明软骨,B组接近纤维软骨,C组与D组细胞以纤维组织为主。PCR检测仅在A、B两组中见Ⅱ型胶原mRNA合成,且A组RNA表达优于B组。结论：体外经外源性透明质酸诱导的间充质干细胞在实验动物体内较好保持了软骨细胞形态与功能,有较好的修复软骨缺损的能力。未经诱导的间充质干细胞在体内关节腔环境的综合影响下可向软骨形态分化,也拥有一定的软骨修复能力,但这种能力明显逊于已诱导干细胞。经诱导的干细胞的成软骨能力随时间迁移逐渐明显。