旋覆花属(Inula L.)属于菊科(Asteraceae),在全世界约有100种,主要分布在欧洲、非洲及亚洲,以地中海地区为主,在我国有20余种和多数变种。研究结果表明,旋覆花属植物在抗肿瘤、抗炎、抑菌、预防肝炎和护肝、及预防和治疗糖尿病等方面都具有很好的生物活性,而倍半萜类成分作为旋覆花属植物中含量最丰富的一类二次代谢产物,被认为是该属植物的主要药效成分。自1968年开始至2007年,从该属植物中共分离鉴定了165个倍半萜类成分,它们以桉烷型、吉玛烷型、伪愈创木烷型、愈创木烷型、以及苍耳烷型为主,其中还包括7个结构新颖独特的倍半萜二聚体类成分。尽管该属植物的研究报道较多,但在化学成分研究上较为深入的仅有欧亚旋覆花(I. britannica)和旋覆花(I. japonica)等数种。在我国,有10余种旋覆花属植物在民间作药用,大多数种都未进行过系统的化学成分和生物活性研究。基于上述,本课题选取了四种旋覆花属药用植物作为对象研究了它们的化学成分及生物活性,其中,研究对象中的旋覆花(I. japonica)和线叶旋覆花(I. lineariifolia)是旋覆花属植物中的两种广布种,而湖北旋覆花(I. hupehensis)和水朝阳旋覆花(I. helianthus-aquatica)则是我国的两种特有种。前期研究结果表明这四种旋覆花属植物都具有丰富的药理活性和长期的药用历史。1.化学成分研究我们采用了各种现代分离纯化技术和鉴定手段对四种旋覆花属植物中富含倍半萜类成分的氯仿部位或乙酸乙酯部位、以及含有少量倍半萜类成分的石油醚部位进行了系统性的化学成分分离鉴定。除去共有成分及未鉴定成分,我们最终从四种旋覆花属植物中分离解析了209个化合物,新化合物87个。这些化合物主要包括了108个倍半萜、31个倍半萜二聚体、16个单萜、4个贝壳杉烷型二萜、1个三萜、4个甾醇类化合物、9个脱辅基类胡萝卜素类化合物、5个邻氨基苯甲酸衍生物、11个黄酮类化合物、6个香豆素、1个苯丙素、2个木脂素、3个生物碱、以及8个其它类化合物。分离得到的108个倍半萜中包括了53个新化合物,分别属于桉烷型、1,10-裂环桉烷型、伪愈创木烷型、愈创木烷型、苍耳烷型、吉玛烷型、卡拉布烷型、榄烷型、及艾里莫芬烷型等9种不同的倍半萜碳骨架类型,基本囊括了目前从该属中发现的所有的倍半萜骨架类型,这一研究结果也从植物化学成分的角度对菊科旋覆花属的植物学分类提供了有力支持,也将对探讨菊科植物的化学成分和类群间的关系提供强有力的支持。分离得到的31个倍半萜二聚体中包括了29个新化合物,远远超过此前报导的倍半萜二聚体的数量。这类倍半萜二聚体成分结构类型多样,分别是桉烷型、1,10-裂环桉烷型、苍耳烷型、愈创木烷型、伪愈创木烷型和吉玛烷型倍半萜内酯与愈创木烷型倍半萜内酯二聚而成。除化合物IJ-56外,其余二聚体都是两个倍半萜内酯通过Diels-Alder反应缩合形成的降冰片烯片断连接而成(链接方式:C-11-C-3′),它们中的IJ-21是目前从自然界中发现的首例由苍耳烷与愈创木烷型倍半萜内酯通过Diels-Alder缩合后形成的外型产物,其余均为Diels-Alder缩合反应的内型产物。化合物IJ-56的两个倍半萜片断之间的独特六元内酯环链接方式为首次在自然界中被发现报道,而桉烷型、苍耳烷型、愈创木烷型、和伪愈创木烷型倍半萜内酯与愈创木烷型倍半萜内酯的二聚体均为首次从旋覆花属植物中被分离报导。这一系列发现也进一步丰富了自然界中倍半萜二聚体的结构类型。在这一系列倍半萜及其二聚体的结构鉴定的过程中,我们共获得了6种不同结构类型倍半萜的单晶X-ray结构,其中包括了两个结构新奇的倍半萜二聚体的单晶X-ray结构。此外,我们还使用了改进的Mosher反应(modified Mosher reaction)、CD谱、以及量子化学计算ECD方法确定了一系列结构新颖的倍半萜及其二聚体类化合物的绝对构型。除倍半萜及其二聚体外,我们还从旋覆花中分离得到了1个新百里香酚类单萜、1个新贝壳杉烷型二萜苷、以及3个新邻氨基苯甲酸衍生物。此外,分离得到的无环类单萜、脱辅基类胡萝卜素类化合物、邻氨基苯甲酸衍生物、香豆素、苯丙素、木脂素、生物碱、酚类等多种类型的化合物均为首次从旋覆花属植物中分离报道。122个已知化合物中,绝大部分均为首次从旋覆花属植物中分离得到。基于水朝阳旋覆花和湖北旋覆花地上部分95%乙醇提取物的化学成分相似度非常大的特点,本课题采用了HPLC/DAD/ESI-MS~n技术和追踪分离鉴定相结合的实验思路来研究水朝阳旋覆花的化学成分,最终确定了其中61个化学成分,通过标准品比较,鉴定了其中40个;再通过UV和ESI-MS~n信息推测了剩余21个化学成分的分子式与结构;通过追踪分离鉴定,确认了其中10个特有成分的结构,包括3个新化合物,结果也与UV和ESI-MS~n信息推测结构相符。这一研究思路在同属植物化学成分研究中具有广泛的应用价值。2.倍半萜二聚体的质谱裂解规律研究及其应用我们利用ESI-MS~n技术考察了旋覆花和线叶旋覆花中分离得到的29个倍半萜二聚体(IJ-34-IJ-54, IL-18-IL-25)的质谱裂解规律。本课题研究前,该类成分的质谱裂解规律研究几乎为空白。通过研究,我们首次总结了该类倍半萜二聚体的主要裂解途径,次要裂解途径,以及各途径中的特征碎片,对它们的裂解机制也进行了探讨,并首次建立了应用ESI-MS~n技术快速分离鉴定该类成分的方法。为了进一步确定该方法的可行性,我们还使用HPLC/DAD/ESI-MS~n技术对旋覆花干燥地上部位95%乙醇提取物的氯仿部位进行了考察,并对其中的倍半萜及其二聚体类成分进行了确认和结构推测。最终通过比较保留时间和ESI-MS~n裂解碎片,再结合之前总结的规律,我们从这32个峰中鉴定了其中的25个化合物,包括了21个倍半萜二聚体(IJ-34-IJ-54)和4个1,10-裂环桉烷型倍半萜内酯(IJ-18-IJ-21),其中化合物IJ-47和IJ-48难以分离。同时我们也利用已总结的ESI-MS~n裂解规律和快速鉴定的方法对剩下的8个化合物进行了结构推导,确认它们的结构类型,并通过特征性碎片信息,确认了3个倍半萜二聚体的结构。由此可见,利用ESI-MS~n技术快速高效地鉴定倍半萜二聚体的方法和思路在旋覆花属植物的成分鉴定中都具有广泛的使用价值。3.倍半萜内酯及其二聚体类化合物的NMR谱规律探讨基于前期研究中获得的大量倍半萜内酯及其二聚体的NMR数据和文献总结,我们首次对旋覆花属植物中的倍半萜内酯及其二聚体类化合物的NMR波谱规律进行了归纳总结,也首次提出并建立了倍半萜内酯单双环系统结合甲基NMR信息判断倍半萜碳骨架类型的方法与思路。这一工作对于进一步研究旋覆花属乃至菊科植物中倍半萜及其二聚体类化合物的结构具有重要的借鉴意义。4.倍半萜内酯及其二聚体的生物活性研究本课题研究的四种旋覆花属植物均有很长的民间药用历史,常作为抗炎抗肿瘤药使用。现代药理学研究也表明它们的提取物均有显著的抗炎抗肿瘤活性,但有效成分不明确。有鉴于此,我们对分离所得的四种旋覆花属植物中的单体化合物,尤其是倍半萜内酯进行了抗炎抗肿瘤活性的筛选,包括对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性和NO代谢抑制活性、对NF-κB激活的抑制活性、以及对6种肿瘤细胞的生长抑制活性的筛选。研究结果表明,倍半萜内酯类化合物具有显著的抗炎抗肿瘤活性,且倍半萜内酯二聚体活性更为突出,其中双旋覆花内酯A (IJ-34)对人肿瘤细胞LOVO和CEM的抑制活性均明显强于阳品对照药阿霉素,IC50值依次为0.478和0.002μM。根据倍半萜类成分的结构特点,我们首次总结了它们的构效关系,这对于开发潜在的抗炎抗肿瘤药物意义重大。TNF-α是一种具有多种生物活性的细胞因子,具有致炎、引发细胞坏死、以及新血管形成等作用,参与了多种复杂炎症或免疫性疾病的发病过程和病情进展过程。尽管关于该细胞因子的研究报导非常多,但直接以TNF-α分子为靶标的小分子抑制剂除2005年SCIENCE报道1例外,该方面的研究几乎空白。我们在前期研究中发现双旋覆花内酯A (IJ-34)等倍半萜内酯二聚体具有很强的抑制NF--B信号通路的活性,通过反向分子对接对NF--B通路的重要靶标进行了虚拟靶向筛选,发现TNF-α为IJ-34的潜在结合蛋白。为进一步证明IJ-34确能直接与TNF-α结合并能阻断其生物学活性,我们先后采用了表面等离子体共振测试(BIACORE3000),酶联免疫分析,及体内外的活性测试等多种方法进行研究,结果证明IJ-34可直接与TNF-α结合,也可抑制TNF-α与其受体的相互作用,并能阻断TNF-α生物学活性,同时也证明了IJ-34的整体抗炎效应。综上所述,本论文基于旋覆花属植物提取物活性突出,但作用成分不明的事实,通过对旋覆花属四种药物植物的系统深入的化学成分研究,阐明了这四种旋覆花属药用植物抗炎抗肿瘤的有效部位及药效物质基础,这将为合理开发利用旋覆花属植物资源提供重要的科学依据,并为寻找及发现新的抗炎抗肿瘤药物提供新的方向。