1、对从通辽某祖代和父母代鹅场主要表现昏睡、持续性下痢、跛行和瘫痪症状,呈现急性败血症病理特征的20～30日龄仔鹅心脏、肝脏、淋巴结和脑组织液等组织分离的4株细菌,进行形态学观察、生长耐受试验、毒力因子表型试验、生化试验等表型特征鉴定,16SrDNA检测和系统进化分析。结果接触媒试验和发酵葡萄糖产气试验阴性、吡咯烷酮芳胺酶试验和胆汁-七叶苷试验阳性,在pH9.6、10℃、45℃、60℃30min、6.5%NaCl等条件下能生长,动力试验阳性。甘露醇、山梨醇、山梨糖等糖(醇)类发酵试验分别为阳性、阳性和阴性,精氨酸双水解酶试验阳性。亚碲酸盐和丙酮酸盐利用试验阳性,依罗霉素敏感试验耐药,甲基葡萄糖吡喃糖苷产酸试验阴性。乳糖、水杨素发酵试验阳性,蔗糖、阿拉伯糖、棉子糖、木糖发酵试验为阴性。4株分离菌与参考菌株ATCC29212及国内分离的典型菌株GU385352等粪肠球菌菌株16SrDNA的同源性均在99.0%以上。致病性试验小鼠半数致死量为1011.2。确定本次从鹅体内分离的4株细菌均为中等致病性粪肠球菌,命名为TLME3株。2、为探讨致鹅败血症粪肠球菌TLME3株毒力基因溶血素激活因子(Cytolysin Activator, CylA)的变异性,研究其功能变化与基因变异的关系。本试验根据NCBI数据库中Genbank上粪肠球菌溶血素激活因子基因序列设计特异性引物,用PCR扩增,连接到pMD18-T载体上,应用PCR及酶切方法检测出阳性克隆并进行序列测定。结果TLME3的溶血素激活因子基因序列与Genbank上L37110、AF329367、AF454824、AY032999的溶血素激活因子基因序列同源性均在99.4%以上。与国内猪源分离株HE1、HE9、HE12、HE30该基因的同源性在99.0%以上,其中与HE9的同源性最高为99.8%。在50bp、385bp、484bp、666bp等处有变异。结果表明,本试验成功克隆获得致鹅败血症粪肠球菌溶血素激活因子基因,该基因高度保守,与L37110等菌株高度同源,仅个别核苷酸处有变异。3、为给研究致鹅败血症粪肠球菌TLME3株毒力基因溶血素激活因子的功能奠定基础。将TLME3溶血素激活因子基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET-CylA重组质粒,经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,用IPTG诱导表达。用High-Affinity GST Resin纯化表达的融合蛋白,并进行SDS-PAGE分离和Western-Blot检测分析。结果得到的溶血素激活因子基因片段为1239bp,与Genbank上L37110等菌株的溶血素激活因子基因序列同源性均在99.0%以上。SDS-PAGE、Western-Blot检测显示蛋白表达带分子量为65.9kD,是溶血素激活因子基因表达产物。结果显示,在BL21 (DE3)中高效表达了TLME3株溶血素激活因子。