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目的:类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,RA主要的病理进展过程为滑膜炎、血管翳生成、软骨破坏及骨破坏,破骨细胞的形成与分化在其中起到了重要的作用。RA滑膜成纤维细胞（RA Synovial Fibroblasts,RASFs）是RA疾病进程中介导滑膜炎和关节破坏的关键效应细胞,研究表明RASFs表达的核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL）增加,刺激破骨细胞生成,导致RA患者关节侵蚀、骨破坏。成纤维细胞生长因子2（Basic Fibroblast Growth Factor,FGF2）是成纤维细胞生长因子（FGFs）家族中的一员,通过与靶细胞上的FGF受体（FGFRs）结合,从而发挥生物活性。FGF2能刺激破骨细胞生成并促进骨吸收。研究表明RA患者的RASFs过量生产FGF2,FGF2在滑膜液中浓度显著增加,与患者的关节破坏程度呈正相关;并且FGF2可以通过诱导RASFs表达RANKL,刺激外周血单核细胞分化为具有骨吸收活性的破骨细胞。正五聚蛋白3（Penteaxin,PTX3）是一种典型的急性期反应蛋白,在RA患者血清、滑膜组织和滑膜液中高表达;PTX3是一种可溶性模式识别受体,可结合多种相应受体配体,参与先天免疫、炎症、血管重塑等多种生物效应,例如PTX3可以以高亲和力和特异性结合FGF2,阻止FGF2与受体结合,从而抑制FGF2诱导的血管新生、平滑肌细胞激活和新生内膜形成。然而,PTX3在FGF2诱导的破骨细胞生成中的作用尚未被研究过,我们将从体外、体内研究PTX3在FGF2诱导的RA破骨细胞形成中的作用及机制。第一部分,研究滑膜组织及滑膜液中FGF2及其受体、RANKL等表达情况,研究FGF2诱导RASFs破骨细胞生成的过程。第二部分,研究PTX3对FGF2诱导的RASFs破骨细胞的生成的影响。第三部分,研究PTX3对胶原诱导关节炎（Collagen-Induced Arthritis,CIA）模型小鼠破骨细胞生成的影响。研究方法:第一部分,膝关节镜及膝关节置换术中,收集确诊活动期RA患者（13例）及膝骨关节炎（Osteoarthritis,OA）患者（10例）的滑膜组织标本和滑膜液进行实验研究。我们通过对RA及OA患者滑膜组织进行HE染色、免疫组化实验、Westernblot实验确定FGF2、RANKL等因子以及FGF2的主要受体硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（Heparan Sulfate Proteoglycan,HSPG）和成纤维细胞生长因子受体1（Fibroblast Growth Factor Receptor 1,FGFR1）在RA患者滑膜组织中的表达情况,接下来我们通过ELISA方法检测FGF2、RANKL等因子以及FGF2的主要受体HSPG和FGFR1的在RA患者滑膜液中的表达情况。我们先后加入FGF2、抗FGF2与RASFs进行培养,观察RASFs细胞生长情况,并通过荧光定量PCR、Westernblot方法测定RASFs中RANKL、细胞粘附因子1（Cell Adhesion Molecule-1,ICAM-1）、骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）等破骨细胞相关因子以及TNFα、IL-6、IL-1β等促炎症性细胞因子的表达情况。接下来我们通过ELISA实验方式检测细胞上清液中RANKL、ICAM-1、OPG、TNFα、IL-6、IL-1β等细胞因子的水平。第二部分,我们将不同浓度重组PTX3（r PTX3）加入FGF2处理的RASFs细胞进行培养,通过对各种细胞因子的检测及分析,并通过TRAP染色鉴定生成的破骨细胞数量,通过125I-FGF2细胞结合实验判断PTX3对FGF2与其受体结合情况的影响,从而观察PTX3对内源性和外源性FGF2诱导的RASFs破骨细胞形成的影响,并分析PTX3对FGF2与RASFs上的FGFR1和HSPG受体结合的作用。第三部分,我们通过II型胶原蛋白注射的方式,制备了胶原诱导关节炎（CIA）小鼠,将重组PTX3注射入CIA小鼠后,对小鼠进行关节炎评分、Micro-CT等检查,对比注射组、CIA组及正常对照组的变化。接下来处死小鼠,取踝关节滑膜组织染色、免疫组化方式检测其中RANKL、OPG等水平,取血清ELISA方法检测RANKL、OPG等浓度,观察PTX3对CIA小鼠体内破骨细胞生成的影响。结果:第一部分,我们发现RA患者的滑膜组织中FGF2及RANKL的表达明显高于OA患者组,RA患者关节滑液中FGF2及RANKL的水平也明显高于OA患者组。免疫组化及q RT-PCR显示FGF2主要受体FGFR1及HSPG在RA滑膜组织中表达情况:HSPG的蛋白及m RNA表达高于OA组,而FGFR1的表达则与OA组无明显差异。我们发现FGF2能够促进RASFs细胞生长,并增加RASFs中RANKL和ICAM-1、RANKL的蛋白和m RNA表达,FGF2能够导致RASFs培养上清液中RANKL浓度和RANKL/OPG的增高,FGF2导致RASFs中TNFα、IL-6、IL-1βm RNA的增高。加入FGF2导致破骨细胞生成数量的增多,而再加入抗FGF2,可以抑制上述的变化。第二部分,我们将不同浓度的PTX3加入FGF2处理的RASFs进行培养,发现PTX3组中RASFs细胞生长情况、细胞中RANKL、ICAM-1的基因及蛋白表达均较FGF2组明显下降,PTX3导致RASFs培养上清液中RANKL浓度和RANKL/OPG比值的降低,并导致RASFs中TNFα、IL-6、IL-1βm RNA的表达受到抑制,导致TRAP染色中破骨细胞生成数量的减少,以上的抑制作用与抗FGF2作用相类似,并随着PTX3浓度的增高,抑制作用逐渐增强。125I-FGF2细胞结合实验中我们发现PTX3能够抑制FGF2与其受体的结合,抑制作用也随浓度的增加而增强。结合第一部分的结果,我们推测PTX3极有可能是通过抑制FGF2与HSPG的结合,而抑制了FGF2诱导RASFs中破骨细胞生成的。第三部分,我们发现PTX3能够改善CIA小鼠关节炎评分以及骨质变化,r PTX3的使用可显著降低CIA小鼠关节局部滑膜中RANKL及RANKL/OPG水平,改善CIA小鼠的关节炎症、软骨和骨质破坏。ELISA方法检测也发现r PTX3的使用可显著降低CIA小鼠血清中RANKL水平及RANKL/OPG比值。结论:RA患者滑膜及关节液中FGF2及RANKL的表达增高,FGF2能够提高RASFs中RANKL、ICAM-1、TNFα、IL-6、IL-1β等的表达水平,导致破骨细胞生成的增多。PTX3能够发挥与抗FGF2类似的作用,抑制FGF2对RASFs的各种影响,该抑制作用在一定浓度范围内随PTX3浓度的增加而增强。注射PTX3能够降低小鼠血清中RANKL浓度和RANKL/OPG比值,改善CIA小鼠的关节炎症、骨质破坏。PTX3很有可能参与了RA的骨破坏过程,并且对该过程有一定的保护作用,这可能为RA发病机制的研究贡献了一份力量,并且对RA的治疗提供了理论依据和潜在的治疗靶点。