番红花是鸢尾科番红花属球茎类草本植物,具有良好的活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效,现代多用于治疗心脑血管疾病和抑郁症。其特有的以藏红花苦素、藏花醛、西红花酸及其糖苷衍生物西红花总苷为代表的类胡萝卜素类化合物是发挥药效的主要成分。番红花柱头是西红花苷等成分合成和积累的场所,柱头作为药用部位其生物量较小而导致产量稀少。整合分析多重组学数据,发掘西红花柱头发育或糖苷合成相关基因,利用分子生物学手段,开展番红花有效成分生源途径解析,并验证影响柱头发育基因的生物学功能。在此基础上,培育高产优质番红花品系,能有效缓解西红花市场的供需矛盾。为了发现潜在的关键酶基因及分子调控基础,本课题针对不同发育时期的番红花柱头同步进行了转录组和代谢组分析,特别监控与西红花苷合成途径相关的代谢流。从转录组中共组装得到269,943条Unigenes,根据差异基因的表达趋势可将所有的差异基因分为7种表达模式,共注释出181条可能参与西红花苷合成的酶基因,筛选出63个可能调控西红花苷合成的转录因子。而代谢组分析指认出15个西红花苷合成途径中的化合物,其含量变化趋势可分为4种模式。为了深入挖掘基因和化合物间的相关性,本研究整合两个组学数据,构建了“转录因子-基因-化合物”共表达网络,切实将候选基因的范围缩小到32条酶基因及28条编码转录因子的转录本。更重要的是,共表达网络筛分别筛选到7、4和4条目前在西红花苷合成途径中未被具体研究的关键酶基因β-GS、ADH和UGT。酿酒酵母的代谢工程研究显示筛选的CsADH酶可催化合成西红花酸,亦证实共表达网络筛选目标基因方法的可靠性。综合“基因-化合物”共表达网络分析及荧光定量PCR结果,指认AGL6b基因的表达与西红花酸随柱头发育的含量变化正相关。而AGL6基因属于MADS-box调控因子家族,该家族在多种模式植物中都表现出调控花发育的功能,由此推测:番红花AGL6b基因与西红花苷合成途径中的次生代谢产物积累有密切联系,可能是通过调控番红花花器官的发育,引起柱头生物量的改变而导致次生代谢物含量变化。因而对来自西红花转录组数据库中的17条MADS-box转录因子进行了系统的生物信息学分析,解读核苷酸序列,及对其编码的氨基酸序列的组成成分、理化性质、信号肽、导肽、跨膜结构域、亚细胞定位、亲疏水性、蛋白质的二级、三级结构及功能域进行预测分析,并将番红花和其他植物的MADS-box蛋白进行同源比对,同时构建了番红花和模式植物拟南芥MADS-box蛋白家族的系统进化树,其结果为今后进一步深入研究番红花MADS-box蛋白的生物学功能提供可靠的参考依据。整合共表达网络及番红花转录组,获得5条在番红花柱头中特异性高表达的MADS-box基因,命名为SCR(Stigma and Crocins Regulator)。为了验证此类基因对于番红花柱头发育或糖苷合成的调控作用,对所得序列进行克隆和分析,初步开展亚细胞定位及拟南芥过表达的实验。CsSCR基因编码的氨基酸分子量在25.0 kDa左右,等电点在9.15左右,均为碱性蛋白。同时结构域分析发现5个蛋白都含有60个氨基酸组成的MADS结构域,以及其后都接有93个氨基酸大小的K-BOX结构域,证明5条蛋白都属于MADS转录因子家族。亚细胞定位实验结果证实5条番红花SCR蛋白的转录因子特性,其定位于细胞核中发挥转录调控作用;而拟南芥过表达实验发现,CsSCR3和CsSCR5可调控拟南芥花发育,导致早花现象出现。综上所述,本研究整合多重组学数据,报道了多个参与西红花苷合成途径的候选基因,为后续开展番红花有效成分生源途径解析奠定了基础,并提供了一个从柱头发育角度提高西红花苷含量的新型代谢工程研究视角。在此基础上培育高产优质番红花品系,切实提升番红花这一重要药用资源的品质,为做强做大番红花产业提供坚实的上游支撑。