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【研究背景及目的】肝癌的发生与多种病原引起的慢性肝炎密切相关。慢性炎症微环境中的炎性因子如TNFα, IL-1β, IL6等在促癌过程起到重要作用。IL-1β是NF-κB信号通路及其他信号通路的强效促炎性因子，NF-κB信号通路在癌前细胞或炎性细胞内的激活被认为是慢性肝炎与肝癌之间的根本联系。IL-1β发挥生物学功能主要是同跨膜受体IL-1RI结合后, IL-1RI招募MyD88。 MyD88再招募IL-1受体相关激酶IRAK4和IRAK1； IRAK4磷酸化IRAK1，并将IRAK1释放入胞质中,从而IRAK1同TRAF6等形成复合物，激活NF-κB或Jun信号通路。p28Gank（也被称为p28、Gankyrin、PSMD10）是2000年首次在肝癌中发现的癌蛋白。本实验室前期的研究表明HCC中高表达p28Gank是不良预后和短生存期的预测因子,可以使癌细胞发生EMT。过表达p28Gank可诱导细胞锚定非依赖性生长和侵袭转移能力提高。p28Gank可以结合Rb促进其磷酸化和降解;还可以同MDM2结合，促进p53的泛素化降解; p28Gank可激活AKT/PI3K/HIF1α途径促进肝癌转移。作为癌基因，p28Gank至今未发现有突变。P28Gank驱动的肿瘤发生基本是由HCC中p28Gank异常高表达引起的。研究p28Gank的转录调控机制对于理解肝癌发生机制具有重要意义。【实验方法】1.生物信息学方法分析p28Gank启动子区并构建p28GANK报告基因质粒及缺失突变质粒；2.运用双荧光素酶报告基因系统筛选对p28Gank转录活性有影响的药物。采用荧光定量PCR和Western Blot对药物作用加以验证。3.采用凝胶阻滞实验（EMSA）研究p28Gank启动子结合蛋白，通过竞争性EMSA确定蛋白结合位点及结合转录因子家族，通过SuperShift EMSA确认结合转录因子和转录辅因子类型。4.采用染色质免疫共沉淀（ChIP）确认转录因子和转录辅因子在胞内对p28Gank启动子的结合。5.通过p28Gank Luciferase报告基因质粒与其它如p300,CBP, IRAK1，HDAC1，HDAC2表达质粒共转染，研究p300,CBP, IRAK1等对p28Gank转录的诱导功能。6.采用RNA干扰技术，即p28Gank Luciferase报告基因质粒与NFYA, NFYB,CBP, p300, IRAK1siRNA共转染反向验证NFYA, NFYB, CBP, p300, IRAK1对p28Gank转录的诱导功能。7.运用核浆分离技术及Western Blot，检测HEK293经刺激后，NFY-p300/CBP分子在胞核胞浆中的分布和变化；8.采用免疫共沉淀技术和Western Blot研究NFYA乙酰化程度；9.采用DEN诱导的大鼠肝癌模型，研究从肝炎，肝硬化发展至肝癌过程中IL-β/IRAK1信号通路的激活情况及对p28Gank转录表达的影响；10.采用荧光定量PCR，Western Blot和免疫组化研究p28Gank和IRAK1在正常肝、肝硬化、癌旁组织及肝癌组织的表达，采用Kaplan-Meier方法分析生存期。【实验结果】1.生物信息学分析：p28Gank启动子属于双向TATA-less promotor，其核心启动子具有INR-DPE结构。2.构建了p28Gank启动子Luciferase报告基因质粒pGL4-p28Gank-1295bp-Luc和pGL4-p28Gank-280bp-Luc及其四个突变体pGL4-Gankyrin295bp-Luc,pGL4-GankyrinΔcSQ2-Luc, pGL4-GankyrinΔINR-Luc，pGL4-GankyrinΔDPE-Luc，确定了p28Gank的最小核心启动子范围。证实了主要p28Gank启动子顺式元件的功能。3.运用双荧光素酶报告基因系统筛选对p28Gank转录活性有影响的药物，发现表皮生长因子（EGF）和白介素1β（IL-1β）可促进p28Gank转录，发现Class I&II型组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA和NaBu可提高p28Gank转录，蛋白酶体抑制剂MG-132和钙通道阻滞剂苯磺酸氨氯地平(Amlodipine,AML)和粉防己碱（Tetrandrine,TET）可抑制p28Gank转录。4.采用凝胶阻滞实验（EMSA）证明p28Gank启动子INR可结合蛋白，通过竞争性EMSA确定了蛋白结合位点，采用转录因子一致识别序列竞争性EMSA发现结合蛋白是NFY家族转录因子。通过SuperShift EMSA确认NFY-p300/CBP复合物结合于p28Gank INR区。ChIP实验证实了NFY-p300/CBP复合物与p28Gank启动子的体内结合。5. NFYA、NFYB、irak1、CBP的siRNA敲除实验表明敲除NFYA、NFYB、IRAK1、CBP、p300后，p28Gank转录活性下降，外转染irak1,p300,CBP后，p28Gank转录活性上升，证实了NFY-p300/CBP复合物和IRAK1对p28Gank的调控功能。6.证实了IL-1β是通过激活IRAK1，引起p300,CBP高表达，进而p300/CBP可使组蛋白乙酰化和NFYA乙酰化，从而激活p28Gank转录的途径。7.依据上述结果，绘制了完整的p28Gank转录调控分子模式图。8.证实了在DEN诱导的大鼠肝癌模型中，肝炎，肝纤维化及肝癌过程中IL-1β/IRAK1信号通路的激活，并促进了p28Gank转录表达。9.证实了肝癌组织中IL-1β和IRAK1的高表达， IRAK1和p28Gank的表达无论在mRNA水平还是蛋白水平，在正常肝，肝硬化和肝癌组织中表现出高度相关性。通过肝癌标本组织芯片的免疫组化染色，发现联合p28Gank和IRAK1进行免疫组化分析是预测早期肝癌预后的更好指标。【结论】本研究阐明了癌基因p28Gank的转录调控模式，发现p28Gank核心启动子是具有INR-DPE结构的双向TATA-less promotor，其中INR可以结合NFY-p300/CBP复合物，控制着p28Gank的转录起始。具有组蛋白乙酰化酶活性的转录辅因子p300/CBP通过对组蛋白和NFYA乙酰化促进转录，而HDAC1和HDAC2则使组蛋白去乙酰化抑制p28Gank转录。本文还阐明了促炎性因子IL-1β对p28Gank的转录激活作用并初步明确了其机理。IL-1β通过激活下游IRAK1上调p300/CBP表达，引起p28Gank转录激活。在DEN诱导的大鼠肝癌模型中，证实了肝炎，肝纤维化及肝癌过程中IL-β/IRAK1信号通路的激活，并促进了p28Gank转录表达。肝癌患者中IL-1β、IRAK1、p28Gank表达上调，其中IRAK1和p28Gank表达在mRNA和蛋白水平均密切相关，联合p28Gank和IRAK1进行免疫组化分析是预测早期肝癌预后的更好指标。本研究首次发现了p28Gank的转录调控分子机制，首次确认NFY-p300/CBP复合物控制着p28Gank转录起始，首次揭示IL-1β/IRAK1炎性信号通路对p28Gank的转录激活作用，为理解慢性肝炎发展至肝癌过程中，IL-1β/IRAK1炎性信号通路和癌蛋白p28Gank的作用提供了新的解释。