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目的本实验以人骨肉瘤U20S细胞经ADM诱导建立的骨肉瘤ADM耐药细胞和相应的耐药细胞裸鼠移植瘤模型为研究对象,观察片仔癀对人骨肉瘤ADM耐药细胞的作用并探讨其可能的机制,为临床应用片仔癀逆转骨肉瘤耐药提供实验依据。方法1、人骨肉瘤U20S细胞ADM耐药细胞株的建立及其耐药机制采用大剂量间隙作用、浓度梯度递增间隙作用建立人骨肉瘤U20S细胞ADM耐药株分别命名为U2OS/ADM1、U2OS/ADM2,光镜及透射电镜下观察细胞形态变化；MTT法绘制生长曲线计算倍增时间,测定其耐药指数及药物敏感性；FCM检测细胞内Rh123蓄积情况；RT-PCR检测MDR1、MRP1及Survivin mRNA的表达；Western blot检测P-gp、MRP1及Survivin蛋白的表达。2、片仔癀对人骨肉瘤U2OS/ADM2细胞的作用采用MTT法确定无细胞毒作用的片仔癀IC10浓度为联用浓度,MTT检测片仔癀、无细胞毒作用浓度的片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞增殖的影响,利用金氏公式求Q值,进行合用效果判断；Hoechst33258染色、Annexin V-FITC/PI双染FCM检测片仔癀、无细胞毒作用浓度的片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞凋亡的影响。3、片仔癀逆转人骨肉瘤U2OS/ADM2细胞耐药的机制采用FCM检测片仔癀对U2OS/ADM2细胞内Rh123蓄积的影响、无细胞毒作用浓度的片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞内ADM蓄积的影响；RT-PCR检测不同浓度片仔癀、无细胞毒作用浓度的片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞Bcl-2、Bax. Survivin、MDR1mRNA表达的影响；Western blot去检测Bcl-2-、Bax、Survivin、P-gp蛋白的表达。4、片仔癀对人骨肉瘤U2OS/ADM2细胞裸鼠移植瘤的作用采用人骨肉瘤耐药株U2OS/ADM2细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察片仔癀、ADM、片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞裸鼠移植瘤体积、重量的影响,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤抑制率(IR),TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡情况,RT-PCR检测Bcl-2、Bax、MDR1mRNA在移植瘤中的表达。结果1、成功建立了人骨肉瘤U20S细胞ADM耐药株U2OS/ADM1、U2OS/ADM2,镜下观察U2OS/ADM1、U2OS/ADM2细胞较亲本细胞U2OS在形态上发生了显著变化,透射电镜观察发现耐药株细胞内空泡增多,核糖体增多,粗面内质网扩张；U2OS/ADM1与U2OS/ADM2细胞倍增时间延长,与U2OS细胞相比差异明显(PF)<0.01)；U2OS/ADMK、U2OS/ADM2细胞的耐药指数(RI)分别为79.63和91.06,同时对紫杉醇、顺铂交叉耐药；细胞内Rh123蓄积量明显低于U2OS细胞(P<0.01),而两种耐药株对Rh123的蓄积无明显差异(P>0.05)；U2OS/ADM1、U2OS/ADM2细胞中MDR1/P-gp、MRP1及Survivin基因及蛋白的表达均明显高于U2OS细胞(P<0.05),且U2OS/ADM2细胞中MRP1的表达较U2OS/ADM1细胞明显上调(P<0.05)。2、片仔癀对U2OS/ADM2细胞增殖具有抑制作用,呈时间和剂量依赖性；片仔癀可促进U2OS/ADM2细胞凋亡,凋亡率随片仔癀浓度的增大而增加；U2OS细胞和U2OS/ADM2细胞对片仔癀的IC50无明显差异(P>0.05),U2OS/ADM2细胞对片仔癀无交叉耐药性。片仔癀对U2OS/ADM2细胞无毒性作用的药物浓度(IC10)为0.4mg/ml。 U2OS/ADM2细胞对ADM的IC50为(14.57±0.15)μg/ml,0.4mg/ml片仔癀与ADM联用后其对ADM的IC50为(6.75±0.29)μ g/ml,逆转指数为2.16；Q值为2.29;0.4mg/ml片仔癀与ADM联用后细胞凋亡率与单用ADM相比明显增加(P<0.05)。3、片仔癀可增加细胞内P-gp底物Rh123的蓄积,下调U2OS/ADM2细胞中Bcl-2、Survivin、MDR1/P-gp的表达,上调Bax表达,且呈剂量依赖性,与对照组相比有明显差异(P<0.05)；0.4mg/ml片仔癀与ADM联用后细胞内ADM荧光强度为对照组的1.27倍(P<0.05),与对照组、单用ADM组相比,联用组Bcl-2、Survivin、MDR1/P-gp的表达下调,而Bax的表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。4、成功建立了U2OS/ADN2细胞裸鼠移植瘤模型,片仔癀与ADM联用组裸鼠移植瘤的体积、重量与片仔癀组、ADM组相比明显降低(P<0.05)。TUNEL检测显示联用组凋亡指数明显高于片仔癀组、ADM组,差异有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR结果显示片仔癀与ADM联用可明显上调Bax mRNA的表达,降低Bcl-2、MDR1mRNA的表达,与单用片仔癀和单用ADM相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1、采用ADM大剂量间隙作用、浓度梯度递增间隙作用法均可建立人骨肉瘤ADM耐药细胞株,耐药机制与MDR1、MRP1、Survivin过表达有关；不同建立方式存在一定差异,浓度梯度递增间隙作用法建立的耐药细胞耐药性更明显。2、片仔癀能够有效抑制U2OS/ADM2细胞的增殖,促进其凋亡,呈时间和剂量依赖性；无细胞毒作用的片仔癀与ADM可产生协同作用,提高U2OS/ADM2细胞对ADM的敏感性,表明片仔癀具有逆转U2OS/ADM2细胞耐药的作用。其机制与抑制P-gp的表达,改变Bcl-2与Bax的比例,下调Survivin的表达有关。3、片仔癀与ADM联用可明显抑制U2OS/ADM2细胞裸鼠移植瘤的生长,促进其凋亡,其机制与上调Bax表达,下调Bcl-2、MDR1的表达有关。