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单萜是一类存在于微生物、植物、昆虫中的异戊二烯类化合物,具有重要的工业应用价值。香叶醇是一种重要的无环单萜,被广泛应用于食品、化妆品等工业中。此外,香叶醇还可以作为抗肿瘤药物、抑菌制剂、生物燃料等。课题组前期工作中,通过模块化代谢工程的策略改造酿酒酵母合成单萜香叶醇,使得香叶醇的产量达到1.69 g/L,该产量也是酿酒酵母中目前文献报道的最高水平。然而,相对于倍半萜,酿酒酵母合成单萜仍然处于较低的水平。造成酿酒酵母合成单萜产量低下的主要原因有以下两方面:（1）酿酒酵母合成单萜前体香叶基焦磷酸（GPP）和关键前体乙酰辅酶A供给不足;（2）酿酒酵母对单萜的耐受性差。本研究针对酿酒酵母单萜合成关键前体乙酰辅酶A供应不足的问题,通过引入外源乙酰辅酶A合成途径,并对该途径进行了调控优化,强化了细胞质中乙酰辅酶A的合成,明显提高了酿酒酵母中香叶醇的产量。具体研究内容如下:（1）在酿酒酵母中,乙酰辅酶A是MVA途径的起始反应物,其充足供给是提高萜类化合物产量的重要保证。然而,乙酰辅酶A的分布在细胞质、线粒体、过氧化物酶体和细胞核中,呈现高度区室化,且各区室之间不能相互穿梭利用。为了增加细胞质中乙酰辅酶A的积累量,本研究在酿酒酵母中引入了外源的柠檬酸裂解酶（citrate lyase,ACL）,该酶可将柠檬酸裂解为乙酰辅酶A和草酰乙酸。以前期工作中一株产香叶醇的工程菌(tVoGES-ERG20F96W-N127W)为出发菌株,分别过表达来源于Yarrowia lipolytica、Mus muculus和Aspergillus nidulans三个不同来源的ACL,结果表明,外源ACL的引入并没有使香叶醇产量得到明显的提高。推测其原因可能是由于ACL的反应底物柠檬酸积累量不足造成的。（2）为了增加细胞质中柠檬酸的积累量,我们通过对柠檬酸代谢途径中的关键基因进行敲除,发现在表达了来源于Yarrowia lipolytica的ACL（YlACL）的菌株中敲除了异柠檬酸裂解酶（ICL1）后,香叶醇的产量和产率较对照菌株分别提高了34%和83%;同时敲除线粒体中异柠檬酸合成酶（IDH1）,进一步提高了香叶醇的产量和产率,分别为63%和90%。（3）为了进一步提高细胞质中柠檬酸的积累量以及柠檬酸裂解过程中产生的草酰乙酸的再循环利用,我们强化了柠檬酸和草酰乙酸在线粒体和细胞质之间的转运,以及草酰乙酸到丙酮酸再生途径。研究结果表明,在双敲除ICL1和IDH1基因的菌株中过表达柠檬酸和草酰乙酸双向转运蛋白YHM2,使得香叶醇的产量提高了1倍,而线粒体内膜的柠檬酸单向转运蛋白并没有提高香叶醇的产量;同时,在敲除ICL1的菌株中过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PCK1）以及丙酮酸激酶（PYK2）促进草酰乙酸到丙酮酸的再生,使香叶醇的产率提高了84%。综上所述,本研究通过在酿酒酵母中引入外源的柠檬酸裂解酶,并从柠檬酸代谢、转运以及草酰乙酸的再循环利用三个环节进行了代谢途径改造,在一定程度上增强了细胞质中乙酰辅酶A的合成,使香叶醇的产量提高1倍以上。本研究采用的改造策略和构建的相关菌株为其它以乙酰辅酶A为前体的高值化合物的合成提供了良好的基础和技术参考。