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目的:确立应用缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)反义寡核苷酸结合放射应用杀伤喉鳞状细胞癌的各种条件和方法,为喉鳞癌的基因治疗开辟新途径。方法1喉鳞癌裸鼠模型的建立选择Balb/c纯系裸鼠80只,鼠龄3-4周龄,体重12-18g,均为雌性,于背部皮下注入2×106Hep-2细胞0.2ml,对照组注射PBS0.2ml。隔离室净化空气层流架中,恒温恒湿,灭菌处理的饲料和水,供自由食用。当肿瘤长至8-10mm时,用于实验。2观察不同放射剂量对荷瘤裸鼠的抑制作用:将肿瘤长至8-10mm的裸鼠30只随机分为六组,每组5只,Ⅰ组2Gy,Ⅱ组5Gy,Ⅲ组10Gy,Ⅳ组15Gy,Ⅴ组20Gy,对照组为0Gy,采用局部分割照射,每次2Gy。照射10天后杀鼠荷瘤取出后称重观察抑瘤情况;部分放入70%的酒精中固定,应用流式细胞技术检测细胞凋亡情况。3在较适放射剂量下应用HIF-1α反义寡核苷酸对肿瘤的抑制作用:将肿瘤长至10mm的裸鼠选择成瘤较好的25只随机分为五组:A组(正义+10Gy),B组(反义+10Gy)C组(空脂质体+10Gy)D组(10Gy)E组(空白对照),每次注射100μg/只(按脂质体:DNA=1:1进行包裹加入等量的细胞培养液,),0.2ml向肿瘤基底部3点以及中央1点注射,每3天注射一次,共8次,每次注射后6小时,对裸鼠肿瘤行Co60局部放射2Gy,每3天测量一次鼠重、瘤体最大长径及最大垂直径,治疗21天后将实验鼠脱颈处死,应用流式细胞仪、免疫组化、电镜观察肿瘤的,观察抑瘤、凋亡情况及相关蛋白表达。结果1注入2×106Hep-2细胞0.2ml后,48h开始长瘤,近3周长至10mm大小。实验组70只裸鼠,7只成瘤弥散,3只未长瘤,0只死亡,2只注入PBS未成瘤,成瘤率95.71%,杀鼠做病理示鳞状细胞癌,分化三级。2不同放疗剂量组:空白组、2Gy组、5Gy组、10Gy组、15Gy组的抑瘤率分别为0、2.841%、9.817%、19.201%、27.822%。经单因素方差分析(P<0.01)。结果说明随着放疗剂量增加,抑瘤率也随之增加,20Gy组因照射剂量较大,裸鼠全部死亡,15Gy组裸鼠皮肤苍白并出现较多红色出血点,裸鼠食量减弱,体重减轻。各组凋亡率分别为12.474±3.009%;12.982±4.064 % ; 15.922±3.840 % ; 19.768±2.602 % ;24.362±2.131%经Kruskal Wallis Test, Mean Score分别为11.10 16.40 10.50 4.00(Chi-square 16.209 P<0.01)。结果说明随着放疗剂量的增加,瘤细胞凋亡率也增加,故选用10Gy为最适放疗剂量。3在较适放射剂量下应用HIF-1α反义寡核苷酸对肿瘤的抑制作用观察结果3.1瘤重的变化及抑瘤率:反义组瘤重最小,抑瘤率为(50.21±8.10)明显高于空白对照、脂质体对照、放疗对照以及正义对照4组(p<0.05)3.2凋亡率及增殖指数:反义组凋亡率最大(34.522±4.159%)增殖指数(41.642±3.596%)明显高于空白对照、脂质体对照、放疗对照以及正义对照4组(凋亡率p<0.05,增殖指数Kruskal-Wallis Test Chi-Square=16.084 P<0.01)3.3免疫组化PV法染色显示:HIF-a正义组胞浆有大量棕色颗粒沉积着色,而反义治疗组表达较少;正义对照组P53表达于胞核呈棕色颗粒浓染,而反义治疗组表达较少;VEGF正义对照组胞浆有大量棕色颗粒沉积着色,而反义治疗组表达较少。3.4流式细胞仪检测结果显示反义治疗组的HIF-1α、P53、VEGF蛋白表FI值(0.98±0.28,2.13±0.03,1.09±0.36)明显低于空白对照、脂质体对照、放疗对照以及正义对照4组(p<0.05)。3.5电镜结果电镜下见空脂质体+放疗组、正义+放疗组、反义+放疗组核膜呈锐角突起,核染色质浓缩,电子密度增加边集于核模下,有的形成半月(Fig17)。线粒体空泡化明显,粗面内质网脱颗粒。空白对照组细胞呈椭圆形,细胞质丰富,核椭圆形略不整形,常染色质丰富,异染色质少,有大而明显的核仁,线粒体轻度空化,粗面内质网轻度脱颗粒。放疗组变性坏死为细胞核的碎片。线位体局部水肿,空泡化,部分和大部分嵴融合、消失,部分和大部分膜消失,粗面内质网脱颗粒。反义+放疗组喉鳞癌细胞局部核膜呈锐角突起,核染色质浓缩电子密度增加,边集于核膜下,形成新月状称为半月,部分细胞膜亦可见球形膨出。线粒体轻度水肿,部分峭排列紊乱,部分嵴消失,粗面内质网有脱颗粒现象(Fig18)。结论:通过对活体裸鼠喉癌移植瘤模型,转染缺氧诱导因子(HIF-1α)反义寡核苷酸结合局部放射治疗,综合流式细胞术、免疫组化、大体标本、电镜结果分析:各治疗组(反义+放疗组;正义+放疗组;空脂质体+放疗组;空白对照组)均有抑瘤效果,其中反义+放疗组效果较其他组明显。