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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)(简称肝癌)是发生率仅次于胃癌和肺癌的恶性极高的肿瘤，迫切需要用于早期诊断和有效治疗的新方法，越来越多的研究致力于寻找特异性肿瘤配体。肿瘤特异性结合因子可以作为体内成像因子用于肿瘤及微转移灶的早期诊断，也可以连接到抗癌药物研制专门针对肿瘤细胞而不损伤正常细胞的肿瘤导向药物。噬菌体展示技术能用于筛选特殊靶标的高亲和力和特异性的结合肽，与完整肿瘤细胞的淘洗过程可以用于筛选与肿瘤细胞表面生物标记结合的肽。本研究旨在筛选并鉴定肝癌细胞特异结合肽，并将其与具有抗肿瘤活性的蜂毒肽串联获得具有靶向抑瘤活性的融合多肽。本研究应用噬菌体随机十二肽库技术进行全细胞消减筛选，通过与阴性分子的预先消减作用，减少非特异结合噬菌体的结合量，从而快速获得与人肝癌细胞HepG2特异结合的噬菌体克隆。四轮筛选后，噬菌体在靶细胞上出现了明显富集，说明筛选过程有效可行；利用ELISA对100个克隆的特异性和亲和力进行初步鉴定，获得31个高亲和力噬菌体克隆，为进一步获得特异性多肽打下了较好基础。利用Clustal X1.86软件对读取的氨基酸序列进行多重比对分析，没有发现普遍的基序模式，但在每条序列均含Arg和Leu/Ile，大多数序列均含有Pro；利用UniProtKB/SWISS-Prot和NCBI/BLAST软件进行同源性分析，发现24个多肽序列与已报道的蛋白序列相似性都不高，具有深入研究的价值；利用ExPASy、HeliQuest和抗菌肽在线数据库等预测分析多肽可能具有的生化特性和二级结构，预测其功能，最终确定序列AM-2,13,22作为进一步活性验证的对象。化学合成多肽AM-2,13,22并部分标记FITC和生物素，利用多肽-噬菌体的竞争性抑制试验、免疫细胞化学、免疫组织化学、免疫荧光等试验鉴定多肽对肝癌细胞/组织的结合特异性。肽-噬菌体竞争性抑制试验表明脱离了噬菌体的多肽AM-2,13,22仍具有HepG2细胞特异亲和力，AM-2浓度为5μM时，抑制率达到82.67%，抑制作用最明显，用于进一步结合活性鉴定；免疫细胞化学和细胞免疫荧光结果表明，AM-2对肝癌细胞HepG2和SMMC-77721亲和力高，而与肝正常细胞HL-7702结合能力较弱；组化和荧光结果表明，AM-2对肝癌组织亲和力很强，而对肝正常组织亲和力很弱，说明AM-2具有用于开发肝癌早期诊断和靶向治疗药物的潜力。以AM-2作为靶向载体，利用刚性Linker（序列为A(EAAAK)2A）在保持各自结构和功能独立的情况下，将AM-2与抗菌肽Melittin串联，合成靶向抗肿瘤肽AM-2-Melittin，并验证其体外抑瘤活性。应用MTT比色法检测融合多肽对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响，结果表明其对肝癌细胞具有选择性杀伤作用，靶向前体的设计未降低Melittin的抗肿瘤活性；应用流式细胞术测定融合多肽与人肝癌细胞的结合率，结果表明AM-2的串联提高了靶向性；检测融合多肽作用后细胞凋亡情况，表明融合肽可特异性地诱导肝癌细胞凋亡，从而抑制细胞增殖；扫描电镜观察AM-2-Melittin作用后人肝癌HepG2和SMMC-7721细胞膜变化，发现细胞膜出现致死性破坏，初步确定融合多肽具有特异性体外抑瘤效果。本研究成功利用噬菌体随机十二肽库技术筛选人肝癌细胞靶向结合肽，证实了其特异性和亲和力，并将其与Melittin串联，验证了其体外抑瘤活性，获得一条特异性靶向抗肿瘤肽，为实现具有抗肿瘤活性的抗菌肽的靶向治疗奠定实验基础。