【摘 要】
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脂肪酶是一种绿色安全的重要工业酶制剂,因其良好的底物特异性,可以催化多种反应,广泛应用于油脂加工、医药、香料等许多工业领域。农副产品和微生物是脂肪酶的重要来源,由于天然脂肪酶存在稳定性差、立体选择性不理想和难以重复使用的问题,适用范围受到很大限制。本文以皱褶假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase,CRL)为模型酶,利用纳米金(Gold nanoparticles,AuNPs)优
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脂肪酶是一种绿色安全的重要工业酶制剂,因其良好的底物特异性,可以催化多种反应,广泛应用于油脂加工、医药、香料等许多工业领域。农副产品和微生物是脂肪酶的重要来源,由于天然脂肪酶存在稳定性差、立体选择性不理想和难以重复使用的问题,适用范围受到很大限制。本文以皱褶假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase,CRL）为模型酶,利用纳米金（Gold nanoparticles,AuNPs）优异的生物相容性以及独特的理化性质,提出了两种新型杂化酶策略,制备CRL-AuNPs杂化酶应用于拆分（R,S）-萘普生甲酯,显著提高了产物的光学纯度和脂肪酶操作稳定性。文中改善脂肪酶性质的方法也可应用于农副产品来源的脂肪酶,为扩大脂肪酶的人工目的性改性提供了理论支持,主要研究内容和结果如下:构建酶促拆分反应体系,以100 mg的CRL为催化剂在微水相中进行手性拆分,于35℃反应96 h。实验结果表明转化率（C）为23.2%,产物对映体过量值（eep）为94.8%,对映体比率（E）为50.3。采用高效液相色谱对反应剩余底物和水解产物定性分析。在不可逆动力学拆分条件下,建立了参数方程并据此绘制C与ees和eep的理论曲线图。利用柠檬酸钠还原氯金酸形成不同粒径AuNPs,CRL与AuNPs在离子键和物理吸附的共同作用下获得CRL-AuNPs（1）杂化酶,研究结果显示,在10 mL浓度为10mg/mL的CRL酶液中加入60 mL平均粒径为14 nm的纳米金,杂化温度为30℃,杂化时间为24 h时制备的杂化酶拆分效果最好。此时拆分反应C为20.0%,eep为97.3%,E为94.1。并利用紫外、荧光、FTIR、TEM等检测手段对制备成功的CRL-AuNPs（1）杂化酶进行表征并探究其二级结构的变化。利用CRL上的还原性氨基酸原位还原氯金酸一步合成CRL-AuNPs（2）杂化酶,利用紫外、荧光、FTIR、TEM、XPS等手段对制备的CRL-AuNPs（2）杂化酶进行表征,通过透射电镜观察到AuNPs呈圆球形均匀分散,XPS结果表明Au4f7/2和Au4f5/2结合能分别为83.5和87.2 eV,证明Au（Ш）已还原为Au（0）。拆分结果表明,杂化最优条件为取10mL浓度10 mg/mL的CRL酶液与1 mL浓度1 mg/L的氯金酸溶液,放入转速100 rpm温度30℃的摇床,杂化15 h获得CRL-AuNPs（2）杂化酶,此条件下杂化酶C为21.4%,eep为98.6%,E为179.3。对最优制备条件下的CRL-AuNPs（1）和CRL-AuNPs（2）杂化酶进行催化特性分析,CRL-AuNPs（1）和CRL-AuNPs（2）杂化酶分别保留了CRL纯酶86.2%和92.2%的活性,E值与游离酶相比提高了87.1%和256.5%,经过6次反复批式反应后酶活力分别保持在初始值的57.3%和69.4%,且CRL-AuNPs（2）的立体选择性几乎未改变。研究发现经AuNPs杂化改造后的脂肪酶,二级结构发生变化,导致立体选择性显著提高,稳定性有所提升,便于重复使用。
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