研究背景大肠癌是一种常见的恶性肿瘤,严重威胁着人类的健康,其发病率呈逐渐上升的趋势。转移是癌症治疗中的难点,乃患者死亡的主要原因,因此探讨大肠癌转移的分子机制,寻找有效的预防和治疗途径是大肠癌研究的重要内容。上皮细胞间质转化态(epithelial-mesenchymal transition,EMT),是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞转分化的现象,目前EMT被看成导致肿瘤进展的病理过程,与侵袭和转移有关系。在EMT的过程中,细胞之间的粘附减少,上皮细胞极性丧失,与周围基质细胞的接触减少,细胞迁移和运动能力增强,同时细胞表型发生改变,丧失上皮表型,如角蛋白丝,E-钙粘素(E-cadherin),而获得间质表型,如波形蛋白(Vimentin),纤维连接蛋白,N-钙粘素,a-SMA等。其中E-cadherin水平的下降可以导致细胞的粘附力降低,使细胞获得易于侵袭和转移的特性,E-cadherin表达的丢失已经被认为是EMT最显著的特征。目前认为EMT的发生过程是由精确的细胞内信号转导机制调控,由微环境因子作用于细胞表面特异性受体,将信号转入细胞内,诱导细胞通路的改变,最终导致基因表达的改变。Tiam1基因(T lymphoma invasion and metastasis)是从鼠T淋巴瘤中克隆出来的基因,全称T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1。Tiam1几乎在所有的肿瘤细胞中都表达,但表达水平根据肿瘤细胞侵袭转移能力的不同而不同。其在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、喉癌、结肠癌等多种恶性肿瘤组织中呈阳性表达并与侵袭转移密切相关。Tiam1对于控制细胞形态、粘附和运动以及信号传导都有重要作用,并能够诱导肿瘤细胞的侵袭转移。文献报道结肠癌中高表达Tiam1的细胞也高表达Vimentin,具有更多的转移表型,同时E-cadherin的表达减少。本课题组前期通过免疫组化检测大肠癌组织中Tiam1与EMT标志物的表达,显示Tiam1的表达与上皮表型标志物E-cadherin、CK呈正相关,而与间质标志Vimentin呈负相关。证实Tiam1与大肠癌的分化和转移有关,其促进大肠癌转移的机制可能与EMT发生有关。并且发现Tiam1基因表达沉默可逆转Lovo细胞的EMT表型,同时其侵袭转移的能力减弱。那么对于不同转移能力的大肠癌细胞,Tiam1与EMT标记物的表达情况怎样?两者又有何关系?将在本研究中探讨。TGF-β1是一种具有多种生物学活性的多肽生长因子,可影响肿瘤细胞的形态,改变其运动及侵袭能力,并能诱导大肠癌细胞发生EMT,此过程由诸多细胞因子和蛋白一起参与,共同调节。MMP-2的主要作用是降解细胞外基质,与肿瘤EMT的发生密切相关,影响肿瘤细胞的增值和迁移等行为。由此可见Tiam1、TGF-β1和MMP-2促进肿瘤侵袭转移都与EMT的发生有关,那么它们之间是否有关联?需进一步研究证实。近年有文献报道EMT与非EMT细胞是共同完成自发转移的过程,EMT细胞通过降解细胞周围基质和血管壁,为非EMT细胞的侵袭转移铺平道路。此观点与以往认为的发生EMT的肿瘤细胞,其迁移能力比非EMT细胞强有不同之处。那么在大肠癌中发生EMT的细胞和非EMT细胞之间是否也存在这样的协同关系呢?本研究将重点从以上三个方面探讨EMT及其相关因素Tiam1、TGF-β1和MMP-2与大肠癌转移的关系,初步探讨EMT及非EMT的细胞在大肠癌侵袭转移中的作用。目的1、检测不同转移能力的大肠癌细胞系中Tiam1与EMT标记物的表达并分析两者之间的关系。2、探讨Tiam1、TGF-β1和MMP-2在大肠癌EMT中的关系。3、探讨EMT及非EMT的细胞在大肠癌侵袭转移中的作用。方法1、用Real time-RT PCR法分析Tiaml mRNA, E-cadherin mRNA和Vimentin mRNA在6种大肠癌细胞系中的表达情况；通过免疫组化检测Tiam1, E-cadherin和Vimentin在LoVo和HT29中的表达；通过考马斯亮蓝染色观察LoVo和HT29的细胞骨架。2、免疫组化检测：应用免疫组化二步法,检测23例大肠正常组织、85例大肠癌和28例淋巴结转移癌中TGF-β1和MMP-2的表达,结合本课题组前期实验Tiam1和E-cadherin在人大肠癌组织中表达的结果,探讨Tiam1与TGF-β1,MMP-2在大肠癌EMT中的关系。3、使用TGF-β1长期诱导大肠癌HT29细胞；应用荧光定量PCR检测诱导前后细胞的Tiam1 mRNA、E-cadherin mRNA和Vimentin mRNA的表达；HE染色观察细胞形态；考马斯亮蓝染色观察细胞骨架；划痕实验观察刺激前、刺激后及两者混合培养后细胞的迁移运动情况。将绿色和红色荧光蛋白质粒分别转染发生EMT的HT29／TGF-β1和非EMT的HT29细胞,使之分别标记上绿光和红光,两者混合培养,进行划痕实验,观察两种细胞的运动情况。结果1、Tiam1与EMT标记物在不同转移能力的大肠癌细胞系中的表达通过对样本定量PCR的Ct值进行相对定量计算分析,经统计学分析结果发现SW480, SW620, SW480/M5, HT29, LoVo和LS174T中Tiam1 mRNA表达量的平均秩次分别为13.00,9.67,17.00,2.33,10.00,5.00,差异具有统计学意义(χ2=14.839, P=0.011)。E-cadherin mRNA的表达量的平均秩次分别为8.00,14.00,11.00,17.00,2.00,5.00,差异具有统计学意义(x2=16.717, P=0.005)。Vimentin mRNA的表达量秩次分别为11.00,14.00,8.00,4.00,17.00,3.00,差异具有统计学意义(x2=16.225,P=0.006)。细胞免疫化学染色检测LoVo细胞的Tiam1表达呈阳性(++), Vimentin表达呈强阳性(+++),都定位于胞浆,E-cadherin表达呈阴性(一)；HT29细胞的E-cadherin表达呈阳性(++),定位于胞膜上,Tiam1和Vimentin表达阴性(一)。LoVo细胞为长梭形或星芒状,两端有较长较细的突起,细胞浆内可见骨架蛋白成蓝色丝网状结构,胞核周围可见点状肌动蛋白小体,HT29细胞大多呈椭圆形,细胞浆少,丝网状的骨架蛋白结构及点状肌动蛋白小体少。2、Tiam1、TGF-β1和MMP-2在大肠癌EMT中的关系TGF-β1在大肠癌和淋巴结转移癌的部分病例中表达减弱或缺失,与大肠癌的分化程度无关。TGF-β1在大肠正常组织、大肠癌及淋巴结转移癌中的表达有显著差异X2=55.928,P=0.000)；两两比较发现,大肠正常组织中TGF-β1的表达低于癌组织(Z=-6.913,P=0.000)；大肠癌组织中TGF-β1的表达低于淋巴结转移癌组织(Z=-2.822,P=0.005)；差异均有显著性；但在大肠高中分化癌与低分化癌中的表达差异无显著性(Z=-1.589,P=0.112)。MMP-2在大肠癌和淋巴结转移癌的部分病例中表达减弱或缺失,与大肠癌的分化程度无关。MMP-2在大肠正常组织、大肠癌及淋巴结转移癌中的表达有显著差异X2=63.079,P=0.000)；两两比较发现,大肠正常组织中MMP-2的表达低于癌组织(Z=-6.979,P=0.000)；大肠癌组织中MMP-2的表达低于淋巴结转移癌组织(Z=-4.381,P=0.000)；差异均有显著性；但在大肠高中分化癌与低分化癌中的表达差异无显著性(Z=-1.854,P=0.064)。Tiam1与TGF-β1、MMP-2表达呈正相关(r=0.209,P=0.015；r=0.486,P=0.000)；TGF-p1与E-cadherin的表达呈负相关,与MMP-2的表达呈正相关(r=-0.196,P=0.024；r=0.445,P=0.000)；MMP-2与E-cadherin的表达无显著相关(r=0.048,P=0.582)。3、EMT及非EMT细胞在大肠癌侵袭转移中的作用10ng/ml TGF-β1连续刺激HT29细胞10d后,Real-time RT-PCR检测HT29中E-cadherin表达下降,差异具有统计学意义(t=-2.969,P=0.041),Vimentin表达上调,差异具有统计学意义(t=3.985,P=0.016), Tiam1的表达差异无统计学意义(t=0.910,P=0.414)。刺激前的HT29细胞为椭圆形,呈融合性生长,细胞间的黏附紧密。TGF-β1连续刺激40d后,细胞形态较之前变梭,细胞间连接不紧密,生长分散。考马斯亮蓝染色观察刺激后的HT29细胞蓝色丝网状结构的骨架蛋白明显增多,相邻细胞间骨架连接不如刺激前紧密。细胞划痕实验结果显示HT29细胞成融合生长,迁移速度不及刺激后的HT29细胞快,两者混合培养后,混合细胞的迁移速度比HT29快,但比刺激后的HT29细胞稍慢,在迁移速度较快的细胞中圆形和梭形的细胞均能见到。使用1μg的红色和绿色荧光质粒DNA转染细胞24h后转染效率最高。混合培养两种发光的细胞,进行划痕实验,48h后可见细胞迁移生长,红色和绿色的细胞在迁移生长的过程中分布均匀。结论1、部分大肠癌细胞的侵袭转移是与Tiam1诱导EMT有关的。2. Tiam1、TGF-β1和MMP-2在大肠癌EMT的过程中有可能有着相互协同作用。3、TGF-β1可诱导大肠癌细胞发生EMT。4、大肠癌中EMT化的细胞可以加速非EMT化细胞的侵袭转移速度。