论文部分内容阅读
目的：
基于网络药理学方法预测孔圣枕中丹（SCPE）干预轻度认知障碍（MCI）的主要药物、成分、靶点及潜在信号通路、生物学过程（BP）、分子功能（MF）及细胞元件（CC）；并以7月龄SAMP8小鼠为研究对象，探讨孔圣枕中丹干预轻度认知障碍小鼠的药理作用及机制，为开展中药改善轻度认知障碍的研究提供理论及实验基础。
方法：
1.以孔圣枕中丹为研究对象，通过网络药理学方法，根据ADMET（吸收/分布/代谢/排泄/毒性）参数，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.1、血脑屏障渗透性（BBB）≥－0.3为筛选条件，使用中国天然产物化学成分库、TCMSP中药系统药理学数据库及分析平台、TCMID、TCM Database@Taiwan、HIT、HerbBioMap、Pub Med、CNKI等平台筛选孔圣枕中丹的活性成分，通过PharmMapper服务器预测各活性成分潜在的活性靶点，通过CTD、TTD、DrugBank等数据库挖掘轻度认知障碍相关的作用靶点，采用STRING、DAVID等数据库分析孔圣枕中丹干预轻度认知障碍可能的作用机制，并运用AutoDock Vina1.1.2软件对潜在的核心靶点进行分子对接。
2.以7月龄，雄性，SAMP8小鼠为研究对象，以同月龄相同遗传背景的SAMR1小鼠为空白对照组。适应性饲养7天后，对全部小鼠（包括SAMR1小鼠）进行Morris水迷宫训练，并筛选出具有认知障碍的SAMP8小鼠40只，随机分为模型组和孔圣枕中丹低、中、高（LD/MD/HD）剂量组，每组10只。另外以10只SAMR1小鼠作为空白对照组。其中，孔圣枕中丹低、中、高剂量组小鼠分别按照2.3g/kg?d、4.6g/kg?d、9.2g/kg?d的剂量给予孔圣枕中丹混悬液灌胃，空白组和模型组小鼠给予相同体积的蒸馏水，各组小鼠给药体积均按照0.1ml/10g计算，连续给药28天，每日1次。分别在给药7d/14d/21d/28d对各组小鼠进行Morris水迷宫测试。末次给药24h后，采用微透析活体取样技术配合高效液相色谱法检测各组小鼠透析液中5-HT、5-HIAA含量；HE染色观察各组小鼠海马CA1~CA3区脑组织的基本病理结构；甲苯胺蓝染色观察各组小鼠海马CA1~CA3区神经元中的尼氏体；Western blot技术检测各组小鼠海马组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、p-PI3Kp85/PI3Kp85、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、Tau蛋白表达。
结果：
1.网络药理学结果通过网络药理学方法，按照ADMET模型（OB≥30%、DL≥0.1、BBB≥-0.3），筛选出SCPE中符合条件的28个活性成分，预测出508个潜在靶点，与收集到的与轻度认知障碍直接、间接相关的靶蛋白取交集获得341个孔圣枕中丹干预轻度认知障碍的潜在蛋白。运用Cytoscape3.7.1软件构建“药物-成分-靶点-疾病（MCTD）”网络图并进行拓扑分析，发现孔圣枕中丹中最主要的一味中药是石菖蒲，远志次之，最主要的三种活性成分分别是β-荜澄茄烯、远志呫吨酮Ⅰ和龙胆根黄素，最重要的3个靶点为ACBD7、RUNX1T1和TJP1。运用STRING数据库构建孔圣枕中丹干预轻度认知障碍的341个靶点的蛋白互作网络（PPI），并通过Cytoscape3.7.1软件对PPI网络进行可视化处理及拓扑分析，获得介数中心性和度均大于均值的关键靶点30个，其中，最重要的前5个靶点分别为EP300、TP53、HSP90AA1、RAC1和CCND1。采用DAVID数据库对孔圣枕中丹干预轻度认知障碍的30个关键靶点进行KEGG、GO富集分析，发现孔圣枕中丹在干预轻度认知障碍的机制中主要参与的KEGG信号通路有癌症通路、癌症中蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路、结直肠癌等，GO条目有蛋白质结合、核、胞浆、膜、胞外体等过程。通过Cytoscape3.7.1软件将孔圣枕中丹干预轻度认知障碍的关键靶点、潜在的KEGG信号通路及GO条目进行可视化处理及拓扑分析，获得5个孔圣枕中丹干预轻度认知障碍的核心靶点，分别为TP53、CCND1、RAC1、CASP3、EP300。运用RCSB PDB数据库获得以上5个核心靶点的空间结构，同时运用PubChem平台获取孔圣枕中丹中28种活性成分的3D结构，随后用AutoDock Vina1.1.2进行分子对接，并用maestro11.9对对接结果进行处理和分析，结果显示对接结果最好的活性成分均来源于石菖蒲和远志，其结合方式主要有Pi键、Pi-cation和氢键。
2.动物实验结果Morris水迷宫结果：给药前（0天），与空白组比较，孔圣枕中丹各剂量组及模型组逃避潜伏期明显延长（P＜0.01），但各组小鼠穿越平台的次数无显著差异（P＞0.05）。给药7天后，与空白组比较，模型组小鼠学习能力降低明显（P＜0.01）；与模型组比较，孔圣枕中丹中、高（MD/HD）剂量组小鼠学习能力增强（P＜0.05）。给药14天后，孔圣枕中丹中、高剂量组小鼠学习能力显著提高（P＜0.01）。给药21天、28天后，孔圣枕中丹各剂量组小鼠学习能力均显著提高（P＜0.01），以中、高剂量组改善效果明显，二者无显著差异（P＞0.05）。给药28天后，孔圣枕中丹各剂量组小鼠记忆能力显著提高（P＜0.01），中、高剂量组改善明显，且二者无显著差异（P＞0.05）。微透析结果：给药28天后，与空白组比较，模型组小鼠透析液中5-HT、5-HIAA水平显著降低（P＜0.01），与模型组比较，孔圣枕中丹中、高剂量组小鼠透析液中5-HT、5-HIAA水平均显著升高（P＜0.01或P＜0.05），而孔圣枕中丹低剂量组（LD）未见显著差异（P＞0.05）。神经病理染色结果：与空白组比较，模型组小鼠海马CA1~CA3区神经元细胞排列松散，数目显著减少，出现明显的细胞坏死、变性等异常病理表现，尼氏体少且小，脱颗粒化或者解体消失，呈散在分布。给药28天后，孔圣枕中丹各剂量组小鼠海马CA1~CA3区上述情况均得到改善，中、高剂量组改善效果明显。Western blot结果：与空白组比较，模型组小鼠海马组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-PI3Kp85/PI3Kp85、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值显著降低（P＜0.01），P62蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），而Tau蛋白表达水平无统计学差异（P＞0.05）。与模型组比较，孔圣枕中丹各剂量组小鼠海马组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-PI3Kp85/PI3Kp85、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值显著升高（P＜0.01），P62蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Tau蛋白表达水平无统计学差异（P＞0.05）。
结论：
1.孔圣枕中丹干预轻度认知障碍可以通过β-荜澄茄烯、远志呫吨酮Ⅰ和龙胆根黄素等活性成分向ACBD7、RUNX1T1、TJP1等关键靶点发挥靶向作用，调控PI3K-Akt、P53等信号通路的方式实现，提示孔圣枕中丹可以通过多成分、多靶点、多途径的方式干预轻度认知障碍。
2.孔圣枕中丹具有改善MCI小鼠学习记忆能力的作用，可以提高MCI小鼠脑脊液内5-HT、5-HIAA水平，改善MCI小鼠神经病理特征。其机制可能与促进PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞自噬有关。
基于网络药理学方法预测孔圣枕中丹（SCPE）干预轻度认知障碍（MCI）的主要药物、成分、靶点及潜在信号通路、生物学过程（BP）、分子功能（MF）及细胞元件（CC）；并以7月龄SAMP8小鼠为研究对象，探讨孔圣枕中丹干预轻度认知障碍小鼠的药理作用及机制，为开展中药改善轻度认知障碍的研究提供理论及实验基础。
方法：
1.以孔圣枕中丹为研究对象，通过网络药理学方法，根据ADMET（吸收/分布/代谢/排泄/毒性）参数，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.1、血脑屏障渗透性（BBB）≥－0.3为筛选条件，使用中国天然产物化学成分库、TCMSP中药系统药理学数据库及分析平台、TCMID、TCM Database@Taiwan、HIT、HerbBioMap、Pub Med、CNKI等平台筛选孔圣枕中丹的活性成分，通过PharmMapper服务器预测各活性成分潜在的活性靶点，通过CTD、TTD、DrugBank等数据库挖掘轻度认知障碍相关的作用靶点，采用STRING、DAVID等数据库分析孔圣枕中丹干预轻度认知障碍可能的作用机制，并运用AutoDock Vina1.1.2软件对潜在的核心靶点进行分子对接。
2.以7月龄，雄性，SAMP8小鼠为研究对象，以同月龄相同遗传背景的SAMR1小鼠为空白对照组。适应性饲养7天后，对全部小鼠（包括SAMR1小鼠）进行Morris水迷宫训练，并筛选出具有认知障碍的SAMP8小鼠40只，随机分为模型组和孔圣枕中丹低、中、高（LD/MD/HD）剂量组，每组10只。另外以10只SAMR1小鼠作为空白对照组。其中，孔圣枕中丹低、中、高剂量组小鼠分别按照2.3g/kg?d、4.6g/kg?d、9.2g/kg?d的剂量给予孔圣枕中丹混悬液灌胃，空白组和模型组小鼠给予相同体积的蒸馏水，各组小鼠给药体积均按照0.1ml/10g计算，连续给药28天，每日1次。分别在给药7d/14d/21d/28d对各组小鼠进行Morris水迷宫测试。末次给药24h后，采用微透析活体取样技术配合高效液相色谱法检测各组小鼠透析液中5-HT、5-HIAA含量；HE染色观察各组小鼠海马CA1~CA3区脑组织的基本病理结构；甲苯胺蓝染色观察各组小鼠海马CA1~CA3区神经元中的尼氏体；Western blot技术检测各组小鼠海马组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、p-PI3Kp85/PI3Kp85、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、Tau蛋白表达。
结果：
1.网络药理学结果通过网络药理学方法，按照ADMET模型（OB≥30%、DL≥0.1、BBB≥-0.3），筛选出SCPE中符合条件的28个活性成分，预测出508个潜在靶点，与收集到的与轻度认知障碍直接、间接相关的靶蛋白取交集获得341个孔圣枕中丹干预轻度认知障碍的潜在蛋白。运用Cytoscape3.7.1软件构建“药物-成分-靶点-疾病（MCTD）”网络图并进行拓扑分析，发现孔圣枕中丹中最主要的一味中药是石菖蒲，远志次之，最主要的三种活性成分分别是β-荜澄茄烯、远志呫吨酮Ⅰ和龙胆根黄素，最重要的3个靶点为ACBD7、RUNX1T1和TJP1。运用STRING数据库构建孔圣枕中丹干预轻度认知障碍的341个靶点的蛋白互作网络（PPI），并通过Cytoscape3.7.1软件对PPI网络进行可视化处理及拓扑分析，获得介数中心性和度均大于均值的关键靶点30个，其中，最重要的前5个靶点分别为EP300、TP53、HSP90AA1、RAC1和CCND1。采用DAVID数据库对孔圣枕中丹干预轻度认知障碍的30个关键靶点进行KEGG、GO富集分析，发现孔圣枕中丹在干预轻度认知障碍的机制中主要参与的KEGG信号通路有癌症通路、癌症中蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路、结直肠癌等，GO条目有蛋白质结合、核、胞浆、膜、胞外体等过程。通过Cytoscape3.7.1软件将孔圣枕中丹干预轻度认知障碍的关键靶点、潜在的KEGG信号通路及GO条目进行可视化处理及拓扑分析，获得5个孔圣枕中丹干预轻度认知障碍的核心靶点，分别为TP53、CCND1、RAC1、CASP3、EP300。运用RCSB PDB数据库获得以上5个核心靶点的空间结构，同时运用PubChem平台获取孔圣枕中丹中28种活性成分的3D结构，随后用AutoDock Vina1.1.2进行分子对接，并用maestro11.9对对接结果进行处理和分析，结果显示对接结果最好的活性成分均来源于石菖蒲和远志，其结合方式主要有Pi键、Pi-cation和氢键。
2.动物实验结果Morris水迷宫结果：给药前（0天），与空白组比较，孔圣枕中丹各剂量组及模型组逃避潜伏期明显延长（P＜0.01），但各组小鼠穿越平台的次数无显著差异（P＞0.05）。给药7天后，与空白组比较，模型组小鼠学习能力降低明显（P＜0.01）；与模型组比较，孔圣枕中丹中、高（MD/HD）剂量组小鼠学习能力增强（P＜0.05）。给药14天后，孔圣枕中丹中、高剂量组小鼠学习能力显著提高（P＜0.01）。给药21天、28天后，孔圣枕中丹各剂量组小鼠学习能力均显著提高（P＜0.01），以中、高剂量组改善效果明显，二者无显著差异（P＞0.05）。给药28天后，孔圣枕中丹各剂量组小鼠记忆能力显著提高（P＜0.01），中、高剂量组改善明显，且二者无显著差异（P＞0.05）。微透析结果：给药28天后，与空白组比较，模型组小鼠透析液中5-HT、5-HIAA水平显著降低（P＜0.01），与模型组比较，孔圣枕中丹中、高剂量组小鼠透析液中5-HT、5-HIAA水平均显著升高（P＜0.01或P＜0.05），而孔圣枕中丹低剂量组（LD）未见显著差异（P＞0.05）。神经病理染色结果：与空白组比较，模型组小鼠海马CA1~CA3区神经元细胞排列松散，数目显著减少，出现明显的细胞坏死、变性等异常病理表现，尼氏体少且小，脱颗粒化或者解体消失，呈散在分布。给药28天后，孔圣枕中丹各剂量组小鼠海马CA1~CA3区上述情况均得到改善，中、高剂量组改善效果明显。Western blot结果：与空白组比较，模型组小鼠海马组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-PI3Kp85/PI3Kp85、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值显著降低（P＜0.01），P62蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），而Tau蛋白表达水平无统计学差异（P＞0.05）。与模型组比较，孔圣枕中丹各剂量组小鼠海马组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-PI3Kp85/PI3Kp85、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值显著升高（P＜0.01），P62蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Tau蛋白表达水平无统计学差异（P＞0.05）。
结论：
1.孔圣枕中丹干预轻度认知障碍可以通过β-荜澄茄烯、远志呫吨酮Ⅰ和龙胆根黄素等活性成分向ACBD7、RUNX1T1、TJP1等关键靶点发挥靶向作用，调控PI3K-Akt、P53等信号通路的方式实现，提示孔圣枕中丹可以通过多成分、多靶点、多途径的方式干预轻度认知障碍。
2.孔圣枕中丹具有改善MCI小鼠学习记忆能力的作用，可以提高MCI小鼠脑脊液内5-HT、5-HIAA水平，改善MCI小鼠神经病理特征。其机制可能与促进PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞自噬有关。