干扰素是一类动物机体产生的多功能分泌蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等生物学功能。β干扰素(Interferon beta，IFN-β)主要由成纤维细胞产生，具有诱导细胞产生多种抗病毒蛋白、增强自然杀伤细胞的活性、增加抗原递呈细胞MHC Ⅰ型分子表达以及抑制白细胞增殖等功能。 猪β干扰素具有抗病毒作用，既可以与疫苗配合使用，增强免疫效果，也可以单独使用，治疗猪病毒性疾病，提高动物的免疫机能。本研究旨在应用毕赤酵母表达系统来分泌表达有活性的重组猪β干扰素，为实现重组猪β干扰素工程化生产和进一步研究其生物学功能提供实验基础。 根据猪β干扰素的核苷酸序列，设计并合成了一对引物P1、P2，根据该基因的酶切图谱和表达载体多克隆位点的分析，在上游引物P1中加入了限制性内切酶EcoRⅠ，在下游引物P2中加入了限制性内切酶Kpn Ⅰ，引物设计时，剔除了基因序列的终止密码子，以便进行后期纯化。 从猪肝脏组织中抽提组织DNA，使用特异性引物P1/P2进行PCR扩增，扩增出猪β干扰素的成熟肽基因，扩增长度为495bp。将目的片断与连接载体pMD18-T连接，经转化大肠杆菌，得到阳性克隆pMD-IFNβ。pMD-IFNβ与表达载体pPICZαC分别经过EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切，然后连接转化大肠杆菌，得到重组表达质粒pPICZαC-IFNβ，送公司测序鉴定。结果显示目的基因完整ORF已经正确插入表达载体pPICZαC中。 重组表达质粒pPICZαC-IFNβ经Sac Ⅰ单酶切电泳后，纯化回收，电击转化感受态的毕赤酵母工程菌X-33，涂布YPDS+ZeocinTM选择性培养基，置28℃温箱培养4～5天，结果获得多个单菌落。通过提高抗生素浓度，筛选出具高抗性的转化子。进行诱导表达，每24h添加一次甲醇，保持终浓度为1.0％。诱导表达3天后，收集菌液，离心，取上清。取少量上清液进行SDS-PAGE电泳分析，可见一条分子量约25Ku和27Ku的清晰蛋白条带，比理论值偏大，可能是蛋白在表达时发生不同程度的糖基化所致，而空载体转化宿主菌的对照未发现特异的蛋白条带。将表达蛋白进行Western-blot分析，显示表达蛋白与小鼠抗猪β干扰素抗体能发生特异的抗原-抗体反应，具有免疫原性。证明表达的蛋白为猪β干扰素。 本研究采用BHK-21细胞-水泡性口炎病毒系统以细胞病变抑制法来测定重组猪干扰素的效价。以保护半数(50％)细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。本实验所表达的猪β干扰素效价为3.52×106U/L。 建立了MTT方法用于分析表达的猪β干扰素对淋巴细胞的活化作用，采用酶标仪检测液体培养基的吸光度值，并对结果进行统计学分析，结果表明表达的蛋白能够增强淋巴细胞的转化和增殖。 本研究成功地构建了重组酵母表达质粒pPICZαC-IFNβ，并在毕赤酵母中对猪β-干扰素实现了正确表达，表达的重组蛋白对VSV病毒在BHK-21细胞上的增殖有抑制作用，并且能够活化淋巴细胞，具有免疫调节作用。证明表达的该蛋白在预防和治疗猪病毒性疾病方面以及在调节机体免疫方面具有潜在的应用前景和推广价值。