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纳米氧化锌（Zinc oxide nanoparticles, ZnO NPs）是食品中常用的食品添加剂，常用于作为食品营养强化剂和用于食品包装作为保护的抗菌剂等，可延长食品的保存期。随着ZnO NPs在食品行业中的广泛应用，增加了ZnO NPs通过胃肠道和肺部的接触机率。据报道，ZnO NPs达到一定浓度对细胞具有毒性效应，人体接触ZnO NPs有可能导致健康并发症。从食品安全的角度出发，为食品行业提供ZnO NPs使用的合理剂量提供理论基础，需要进一步研究以揭示ZnO NPs在食品中应用后所带来的生物学效应。
人类食用纳米相关食品，有意或无意识地接触和暴露于这些工程纳米材料（ENMs）。其中大多数程序性细胞死亡方式（PCD）与ENMs诱导的细胞毒性有关。铁死亡（Ferroptosis）是最近公认的程序性细胞死亡（PCD），它与多种疾病和功能障碍有关。我们应该评估是否在 ENMs 暴露时发生了铁死亡并研究其相应的机制，本文研究了食品中常用的食品添加剂ZnO NPs破坏细胞的氧化平衡效应及其导致细胞铁死亡的作用机制。
第一部分：该部分旨在研究ZnO NPs通过引发人脐静脉内皮细胞（HUVECs）发生氧化应激和线粒体损伤诱导细胞铁死亡的分子机制。第一阶段，首先检测了ZnO NPs在不同浓度作用下的细胞毒性，分别通过CCK8和LDH实验发现ZnO NPs对HUVECs具有明显的生长抑制和细胞膜破坏作用。Annexin V / PI染色结果显示ZnO NPs造成了HUVECs发生细胞凋亡，用AO-EB染色进一步证明随着ZnO NPs浓度的增加，细胞数量显着减少，坏死细胞增多。由此证明ZnO NPs对HUVECs具有显著的生物毒性效应。第二阶段检测了细胞氧化应激的相关指标，通过GSH， GSH-px和ROS，结果证明ZnO NPs引起HUVECs发生了氧化应激。同时检测了MDA水平，并使用RT-qPCR分析了ACSL4和ALOX15的mRNA水平，与对照组相比，随着ZnO NPs处理浓度的升高基因的表达水平都显著增加。同时通过siRNA干扰ACSL4和ALOX15的表达后发现ROS明显下降，证明ZnO NPs引起HUVECs 发生了脂质过氧化。第三阶段，检测了铁死亡相关分子 GPX4 的蛋白水平和mRNA水平随浓度梯度降低，铁死亡标志性蛋白PTGS2的mRNA水平随浓度梯度增加。接下来阐明了铁死亡的发生在ZnO NPs引起细胞毒性中的作用。在加入铁死亡，凋亡，自噬和坏死性凋亡的抑制剂后均缓解了ZnO NPs引起的细胞毒性。同时选用HUVECs作为研究对象，并通过实验发现HUVECs可在Erastin的诱导下发生铁死亡，排除细胞特异性。第四阶段，为进一步研究细胞死亡的生化和形态学特征及其作用具体机制。在此，我们以HUVECs作为研究对象，考察了ZnO NPs处理后，ZnO NPs对细胞线粒体形态学的影响及其调节机制进行研究。根据以上研究可知：ZnO NPs引起HUVECs发生脂质过氧化，线粒体损伤，进而促进细胞铁死亡的发生，ZnO NPs可诱导细胞发生PCD。
第二部分：ZnO NPs通过Zn2+泄露诱导HUVECs铁紊乱介导细胞发生铁死亡机制分析。根据第一部分研究发现铁螯合剂DFO缓解了ZnO NPs诱导的细胞死亡，因此我们进一步研究了ZnO NPs对铁稳态的影响。第一阶段通过RT-qPCR分析了介导铁输入基因TFRC和二价金属转运蛋白DMT1水平，TFRC和DMT1的mRNA水平均显著上升，证明ZnO NPs作用细胞后增加了铁的摄取。同时检测了铁输出基因FPN1的mRNA水平，我们发现ZnO NPs在转录水平上FPN1明显增加。但是我们发现在ZnO NP暴露时增强的Bach1和MZF1 mRNA水平，这与FPN1表达增加相矛盾。这一结果促使我们需要更多的证据证明ZnO NPs诱导的铁失调。第二阶段，我们通过Lillie亚铁染色试验发现 ZnO NPs组中亚铁含量的增加，同时ZnO NPs显着下调FTH和FTL的mRNA水平，WB检测发现铁输入蛋白TFRC和DMT1显著上调，铁储存蛋白FTH和FTL相应地显着下调。这些结果表明细胞铁池内铁的增加，线粒体铁转运和利用的出现障碍，表明线粒体铁过载。第三阶段首先通过超分辨共聚焦显微镜观察细胞内F-ZnO NPs和Zn 2+的相对含量，结果发现，ZnO NPs作用细胞后发现ZnO NPs进入细胞内，同时细胞内Zn 2+含量增加。然后发现F-ZnO NPs泄露的Zn2 +主要集中在溶酶体区室中。最后讨论了Zn2+是否参与了ZnO NPs诱导的细胞铁死亡，通过RT-qPCR检测了Zn2+给药后细胞铁死亡相关基因水平，其结果与ZnO NPs检测结果一致。同时通过Lillie亚铁染色试验发现铁染色Zn2+同样导致了胞内铁的积累。这些结果表明ZnO NPs引起HUVECs发生铁紊乱，并由此引起线粒体损伤，同时ZnO NPs泄露的Zn2+参与了ZnO NPs引发的HUVECs铁死亡。
第三部分：ZnO NPs和Zn2+通过p53共同介导HUVECs铁死亡的分子机制研究。第一阶段通过RT-qPCR和蛋白质印迹结果显示，ZnO NPs分别增加p53 mRNA和蛋白质的表达。使用p53 siRNA在ZnO NPs处理的HUVEC中，降低细胞内ROS水平和凋亡率的降低和PTGS2的mRNA水平表达降低。第二阶段，p53与系统Xc-转运蛋白亚基胱氨酸/谷氨酸转运蛋白（SLC7A11）结合，并且SAT1作为p53靶基因，可增强ALOX15的表达。RT-qPCR结果表明，与对照组相比，p53 siRNA显着缓解了SLC7A11的降低，以及降低了ZnO NPs暴露导致的SAT1水平。第三阶段，由于ZnO NPs暴露诱导p53的表达，同时发现当敲除p53后，显著降低了细胞凋亡。因此，接下来我们通过分别加入铁死亡抑制剂和凋亡抑制剂后，检测凋亡相关蛋白和铁死亡相关蛋白的表达，发现在p53的调控下，ZnO NPs诱导HUVECs发生了铁死亡与凋亡的分子串扰（crosstalk）。综上，ZnO NPs诱导的铁死亡由p53介导，p53的激活是由于细胞内Zn2+浓度的增加，并且由p53诱导HUVECs发生了铁死亡与凋亡的crosstalk.
人类食用纳米相关食品，有意或无意识地接触和暴露于这些工程纳米材料（ENMs）。其中大多数程序性细胞死亡方式（PCD）与ENMs诱导的细胞毒性有关。铁死亡（Ferroptosis）是最近公认的程序性细胞死亡（PCD），它与多种疾病和功能障碍有关。我们应该评估是否在 ENMs 暴露时发生了铁死亡并研究其相应的机制，本文研究了食品中常用的食品添加剂ZnO NPs破坏细胞的氧化平衡效应及其导致细胞铁死亡的作用机制。
第一部分：该部分旨在研究ZnO NPs通过引发人脐静脉内皮细胞（HUVECs）发生氧化应激和线粒体损伤诱导细胞铁死亡的分子机制。第一阶段，首先检测了ZnO NPs在不同浓度作用下的细胞毒性，分别通过CCK8和LDH实验发现ZnO NPs对HUVECs具有明显的生长抑制和细胞膜破坏作用。Annexin V / PI染色结果显示ZnO NPs造成了HUVECs发生细胞凋亡，用AO-EB染色进一步证明随着ZnO NPs浓度的增加，细胞数量显着减少，坏死细胞增多。由此证明ZnO NPs对HUVECs具有显著的生物毒性效应。第二阶段检测了细胞氧化应激的相关指标，通过GSH， GSH-px和ROS，结果证明ZnO NPs引起HUVECs发生了氧化应激。同时检测了MDA水平，并使用RT-qPCR分析了ACSL4和ALOX15的mRNA水平，与对照组相比，随着ZnO NPs处理浓度的升高基因的表达水平都显著增加。同时通过siRNA干扰ACSL4和ALOX15的表达后发现ROS明显下降，证明ZnO NPs引起HUVECs 发生了脂质过氧化。第三阶段，检测了铁死亡相关分子 GPX4 的蛋白水平和mRNA水平随浓度梯度降低，铁死亡标志性蛋白PTGS2的mRNA水平随浓度梯度增加。接下来阐明了铁死亡的发生在ZnO NPs引起细胞毒性中的作用。在加入铁死亡，凋亡，自噬和坏死性凋亡的抑制剂后均缓解了ZnO NPs引起的细胞毒性。同时选用HUVECs作为研究对象，并通过实验发现HUVECs可在Erastin的诱导下发生铁死亡，排除细胞特异性。第四阶段，为进一步研究细胞死亡的生化和形态学特征及其作用具体机制。在此，我们以HUVECs作为研究对象，考察了ZnO NPs处理后，ZnO NPs对细胞线粒体形态学的影响及其调节机制进行研究。根据以上研究可知：ZnO NPs引起HUVECs发生脂质过氧化，线粒体损伤，进而促进细胞铁死亡的发生，ZnO NPs可诱导细胞发生PCD。
第二部分：ZnO NPs通过Zn2+泄露诱导HUVECs铁紊乱介导细胞发生铁死亡机制分析。根据第一部分研究发现铁螯合剂DFO缓解了ZnO NPs诱导的细胞死亡，因此我们进一步研究了ZnO NPs对铁稳态的影响。第一阶段通过RT-qPCR分析了介导铁输入基因TFRC和二价金属转运蛋白DMT1水平，TFRC和DMT1的mRNA水平均显著上升，证明ZnO NPs作用细胞后增加了铁的摄取。同时检测了铁输出基因FPN1的mRNA水平，我们发现ZnO NPs在转录水平上FPN1明显增加。但是我们发现在ZnO NP暴露时增强的Bach1和MZF1 mRNA水平，这与FPN1表达增加相矛盾。这一结果促使我们需要更多的证据证明ZnO NPs诱导的铁失调。第二阶段，我们通过Lillie亚铁染色试验发现 ZnO NPs组中亚铁含量的增加，同时ZnO NPs显着下调FTH和FTL的mRNA水平，WB检测发现铁输入蛋白TFRC和DMT1显著上调，铁储存蛋白FTH和FTL相应地显着下调。这些结果表明细胞铁池内铁的增加，线粒体铁转运和利用的出现障碍，表明线粒体铁过载。第三阶段首先通过超分辨共聚焦显微镜观察细胞内F-ZnO NPs和Zn 2+的相对含量，结果发现，ZnO NPs作用细胞后发现ZnO NPs进入细胞内，同时细胞内Zn 2+含量增加。然后发现F-ZnO NPs泄露的Zn2 +主要集中在溶酶体区室中。最后讨论了Zn2+是否参与了ZnO NPs诱导的细胞铁死亡，通过RT-qPCR检测了Zn2+给药后细胞铁死亡相关基因水平，其结果与ZnO NPs检测结果一致。同时通过Lillie亚铁染色试验发现铁染色Zn2+同样导致了胞内铁的积累。这些结果表明ZnO NPs引起HUVECs发生铁紊乱，并由此引起线粒体损伤，同时ZnO NPs泄露的Zn2+参与了ZnO NPs引发的HUVECs铁死亡。
第三部分：ZnO NPs和Zn2+通过p53共同介导HUVECs铁死亡的分子机制研究。第一阶段通过RT-qPCR和蛋白质印迹结果显示，ZnO NPs分别增加p53 mRNA和蛋白质的表达。使用p53 siRNA在ZnO NPs处理的HUVEC中，降低细胞内ROS水平和凋亡率的降低和PTGS2的mRNA水平表达降低。第二阶段，p53与系统Xc-转运蛋白亚基胱氨酸/谷氨酸转运蛋白（SLC7A11）结合，并且SAT1作为p53靶基因，可增强ALOX15的表达。RT-qPCR结果表明，与对照组相比，p53 siRNA显着缓解了SLC7A11的降低，以及降低了ZnO NPs暴露导致的SAT1水平。第三阶段，由于ZnO NPs暴露诱导p53的表达，同时发现当敲除p53后，显著降低了细胞凋亡。因此，接下来我们通过分别加入铁死亡抑制剂和凋亡抑制剂后，检测凋亡相关蛋白和铁死亡相关蛋白的表达，发现在p53的调控下，ZnO NPs诱导HUVECs发生了铁死亡与凋亡的分子串扰（crosstalk）。综上，ZnO NPs诱导的铁死亡由p53介导，p53的激活是由于细胞内Zn2+浓度的增加，并且由p53诱导HUVECs发生了铁死亡与凋亡的crosstalk.