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大戟科蓖麻属植物—蓖麻是我国重要的油料作物,其植株种子蓖麻子作为有毒中药载于《中国药典》。蓖麻子中含有大量的蓖麻毒蛋白(又称蓖麻毒素),其来源广、制备简单、毒性高,在生物农药、免疫毒素类抗肿瘤药物方面已开展了大量实际应用。另外,国际范围内,由于蓖麻子、蓖麻毒蛋白误服或投毒引发的人员事件屡有发生,对于毒蛋白而言,其灭活后不再产生高毒性,仅活性毒蛋白构成明显危害。因此,亟需发展针对痕量活性蓖麻毒蛋白的灵敏、准确分析检测新方法。研究团队前期基于基质辅助激光解吸附电离质谱(MALDI-MS),发展了针对核苷酸底物的特异脱嘌呤活性测定新方法,可实现痕量Ⅱ型核糖体失活蛋白(RibosomeInactivating Protein-Ⅱ,RIP-Ⅱ)的活性测定。但该方法还存在对于复杂样品的适用性问题,基质结晶状态严重妨碍其在多类型样品、多种灭活方式评价中的应用。本学位论文则在研究团队前期基础之上,以制备和纯化出微量毒素蛋白为物质前提,从头构建了液相色谱-紫外光谱-质谱检测(LC-TUV-QDa)方法这一核心,结合脱嘌呤活性检测方式,以不同类型的寡核苷酸底物分子对接特征为指导,针对脱嘌呤反应的寡核苷酸底物和产物,实现了对活性蓖麻毒蛋白生物分子的高灵敏、高准确分析测定。进一步基于该方法,获得了不同底物的酶反应动力学参数,从而筛选了基于结构改造的多条寡核苷酸序列,以完成优选底物或抑制剂的评价。全文共分为五章:第一章为文献综述,从以蓖麻毒蛋白为代表的核糖体失活蛋白为切入点,首先概述了核糖体失活蛋白的定义、分类及结构特点、毒性机制,以及与蓖麻毒蛋白存在特异结合的分子及其分析检测方法,重点对活性毒蛋白的分析检测、蓖麻毒蛋白作为rRNAN-糖苷酶的酶学特征进行了总结和评述。并引出本学位论文的立题依据与研究内容。第二章,针对不同来源、不同浸提方法的蓖麻种子,采用了亲和层析法及尺寸排阻层析法,微量制备和分离纯化得到毫克级蓖麻毒蛋白及蓖麻凝集素,纯度达到了电泳纯(95%),总产率为0.02%-0.1%之间,并进行了多技术方法结构鉴定及表征,包括SDS-PAGE、肽质量指纹图谱MALDI-MS鉴定、细胞毒性测定及凝集素活性等。对不同来源、时间、浸提方法得到的蓖麻毒蛋白/蓖麻凝集素产率进行对比分析,为浸提方法的优化和种子的储存时间对提取效率的影响提供参考,为构建活性蓖麻毒蛋白的准确定量方法提供物质基础。第三章,解决了蓖麻毒蛋白、寡核苷酸底物三维模型的构建难题,完成了 H-dock分子对接模拟及获得如△G、RMSD值等相关参数,从而对蓖麻毒蛋白作为N-糖苷酶催化水解寡核苷酸底物提供模拟指导信息。对于9条DNA、RNA、dA杂化RNA(简称Rd)类型、不同长度的寡核苷酸底物,特别揭示了不同酸度条件(pH4.0、pH7.4)对蓖麻毒蛋白-寡核苷酸底物结合的可能影响。结果提示,体外分子水平上,Rd12与蓖麻毒蛋白的结合在pH 7.4下比pH 4.0更易发生;且随着底物长度延长,底物与蓖麻毒蛋白的结合作用呈下降趋势。为构建活性蓖麻毒蛋白的准确定量方法提供理论基础。第四章,基于不同类型的寡核苷酸底物,构建了一种灵敏、快速、准确的活性蓖麻毒蛋白LC-TUV-QDa定量分析新方法。针对九条寡核苷酸底物进行了液相色谱方法和质谱条件的全面系统优化,最终以BEH C18为固定相,15mM 丁胺(BA)、50mM六氟异丙醇(HFIP)为流动相进行梯度洗脱的条件下得到最佳分离效果及良好的质谱响应信号。QDa和TUV的良好结合,较好地解决了寡核苷酸的精准定性、灵敏定量,以及活性蓖麻毒蛋白的准确定量问题。攻克反应体系与质谱进样的兼容性,巧妙发展了强阳离子交换-枪头(SCX-tip)为简捷高效的样品前处理方式。并进行了方法学验证,线性范围为1-5000 ng/mL;以底物的减少量进行定量,获得较高灵敏度,LOD为1ng/mL;同时还可利用产物之一—腺嘌呤的增加量来进行定量,但LOD仅达到100 ng/mL,也说明针对寡核苷酸建立分离分析方法的必要性。第五章,在所构建的LC-TUV-QDa定量分析新方法基础上,比较筛选了九条寡核苷酸底物,证明了杂化的寡核苷酸Rd12是最优底物,亦验证了第三章中的分子对接结果。上述活性蓖麻毒蛋白定量新方法同时也是一种良好的酶动力学测定手段。我们首先测定了 Rd12的酶反应动力学参数,继而评价筛选了系列不同位点杂化、甲基化、LNA修饰的Rd12类似物,发现RNA12-6,8-dA等是更优底物,以及初步明确RNA12-6mA、Rd12-6mdA、Rd12-6AP等是合适的抑制剂。综上所述,本论文以蓖麻毒蛋白与其寡核苷酸底物之间的相互作用为基础,建立了分子对接理论指导下的LC-TUV-QDa活性蓖麻毒蛋白测定新方法,继而筛选和优选了以Rd12为核心的系列寡核苷酸底物或抑制剂,这就为揭示蓖麻毒蛋白作为rRNA N-糖苷酶催化水解寡核苷酸底物的机制方面提供了坚实的方法和数据基础,预期将会在抑制剂筛选、核糖体失活蛋白活性机制、灭活评价等方面发挥重要价值。