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灰树花[Grifola frondosa(Dicks.)S.F.Gray]是一种珍稀的食药用菌,具有独特的口感风味和高效的医疗保健效果,其市场需求与日俱增。目前,国内灰树花栽培菌种主要来自野生驯化或国外引进,存在着适应性差、多糖含量低、转化率低等不足,需要更多的优良品种,提高灰树花的产量与品质。我国的灰树花生产主要是传统农业栽培模式,遭遇高温会导致减产甚至绝收。本研究综合菌丝拮抗实验、基于内转录间隔区(internal transcribed space,ITS)序列的系统发育分析及简单序列重复区间(inter-simple sequence repeat,ISSR)和SRAP(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)分子标记方法,分析42株灰树花的遗传多样性,明确菌株间的亲缘关系。结合栽培品比实验,选择亲缘关系远、综合农艺性状互补的优良亲本菌株进行单单杂交,获得优良的杂交菌株。同时克隆灰树花苯丙氨酸解氨酶基因(phenylalanine ammonia lyase gene of Grifola frondosa,GfPAL),分析GfPAL在不同高温处理条件下的表达,探究GfPAL在灰树花响应高温胁迫中的生物学功能,为耐高温品种选育提供科学基础。全文结果总结如下:(1)菌丝拮抗实验将42株灰树花分为17组。基于ITS序列构建的系统发育树可以将来自亚洲和美洲的灰树花区分开,说明灰树花的地理距离和遗传距离存在一定的相关性。ISSR和SRAP两种分子标记的综合聚类分析结果显示,当遗传相似系数为0.779时,将42株灰树花划分为6大类群,表明42株灰树花的遗传多样性丰富。栽培品比实验筛选出金乡灰树花、灰3、灰4、灰树花GF54、庆灰151和庆灰152这6个农艺性状优良的菌株。综合以上实验结果,选择野生菌株梯灰1号和栽培品种庆灰151作为杂交亲本。(2)亲本菌株梯灰1号和庆灰151各取10个孢子单核体进行单单杂交,设置100个杂交组合,通过显微镜镜检锁状联合及与亲本的拮抗实验获得65个杂交子。选23个菌丝生长速度快、生长势强的杂交子进行工厂化小试栽培实验,筛选出7株农艺性状优良的杂交菌株,其中zj86综合性状最好,其朵型大、子实体颜色深、菌管短,产量为291.30 g/袋,比亲本菌株梯灰1号和庆灰151分别提高74.50%(P<0.01)和20.53%(P<0.01),生物学转化率在50%以上,子实体多糖含量为4.74%,比亲本菌株梯灰1号和庆灰151分别提高33.52%(P<0.01)和11.52%(P<0.05)。对筛选出的7个杂交菌株进行ISSR和SRAP分子标记鉴定,结果显示,杂交子与亲本之间都有不同程度的遗传差异,是真正的新菌株。(3)对收集的42株灰树花和65个杂交菌株进行高温处理,筛选耐高温菌株。经37℃处理48 h,初步筛选出8个耐高温菌株和4个高温敏感型菌株。对初筛的8个耐高温菌株39℃处理48 h,4个高温敏感型菌株35℃处理48 h,进行复筛,根据高温胁迫后菌丝恢复生长速度和长势,最终筛选出耐高温菌株GGMCC5.404,高温敏感型菌株鲁迁3号。(4)克隆了GfPAL的cDNA和基因组序列。采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)分析37℃处理0 h、8 h、24 h、36 h、42 h、48 h条件下,耐高温菌株CGMCC5.404、高温敏感型菌株鲁迁3号和主栽品种庆灰151中GfPAL的表达。结果,在3个菌株中GfPAL的表达量都呈现出先上升后下降再升高的趋势,且都在8 h时达到最高值,此时,CGMCC5.404中GfPAL的相对表达量是鲁迁3号的24.15倍。在整个高温胁迫过程中,鲁迁3号菌丝中GfPAL的表达量低且变化较小,而CGMCC5.404中的相对表达量和变化幅度都显著高于鲁迁3号。本研究结果表明高温胁迫引起了GfPAL显著的表达变化,GfPAL参与了灰树花对高温胁迫的响应,并且与灰树花菌株的耐热性密切相关。