胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道恶性肿瘤。近年来,其发病率在世界各地均有迅速增加,在男性居恶性仲瘤死亡因为的第五位,在女性居恶性肿瘤死亡因为的第四位,5年生存率仅为1％-4％[1-4]。胰腺癌早期一股没有明显症状,出现临床症状就诊时往往已发生转移,丧失手术时机,且由于其转移倾向以及对细胞毒性化疗药物产生耐受性,而导致传统非手术疗法通常无效,预后极差。目前临床上对晚期胰腺癌缺少有效的治疗方法。因此,迫切需要进一步深入探讨其发生、发展的分子机制,从而寻找更有效的早期诊断与治疗措施,改善其预后。　　 DNA甲基化是重要的基因表观修饰方式之一[5]。DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达[6]。DNA的甲基化是在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5端的胞嘧啶转变为5’甲基胞嘧啶[7]。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列,但是它调控了基因的表达。近年,研究表明在多种人类肿瘤基因组中,广泛低甲基化和部分区域的高甲基化共存是DNA甲基化水平总的特征,5’端CpG岛局部高甲基化致抑癌基因失活是引起细胞恶性转化的重要步骤[8]。　　 DNMTs家族中主要有DNMT1,DNMT2,DNMT3a,DNMT3b四种酶[9]。DNMT1是在体细胞中最丰富的甲基转移酶,被认为是主要的具有维持甲基化作用的酶。目前认为甲基转移酶的表达水平反映了肿瘤中增殖细胞的生理状态和各种分化缺陷。研究发现,甲基转移酶活性增加是所有转化细胞的特征之一,甲基转移酶活性增加能诱导细胞转化,这可能是CpG岛甲基化程度的提高使抑癌基因表达受抑制或影响了细胞周期。　　 多项研究证明基因异常甲基化在多种肿瘤的发生、发展过程中起作用,其中,DNMTs在基因的异常甲基化中起了非常重要的作用[10]。另外,靶向性的沉默DNMT1可以引起肿瘤细胞的生长抑制、凋亡增加伴有DNA甲基化改变。Peng等研究发现多个胰腺癌相关基因甲基化与DNMT1蛋白表达相关,同时发现在胰腺导管上皮内瘤变向进展期胰腺癌的发展过程中,DNMT1起了非常重要的作用[11]。Rhee等发现在结肠癌HCT116细胞株中靶向性沉默DNMT1基因,只能引起细胞总体甲基化水平下降20％,并不能有效引起抑癌基因启动子的去甲基化和抑癌基因的重新表达；进一步研究发现同时剔除DNMT1和DNMT3b基因,可以引起细胞总体甲基化水平下降95％,引起许多抑癌基因的重新表达,并有效抑制了结肠癌细胞的生长[12]。Oridate等利用siRNA干扰人肺非小细胞癌A549细胞株后,使DNMT1蛋白表达明显降低,对细胞生存有明显抑制作用,使生存率下降至原先的75％和65％,且抑制作用明显高于甲基转移酶抑制剂(5-aza-dC)；同时抑癌基因p21的表达明显升高[13]。Suzuki等研究发现通过沉默DNMT1基因可以使非小细胞肺癌NCI-H1299和乳腺癌HCC1954细胞的RASSF1A,p16ink4A,CDH1和HPP1基因启动子的甲基化水平降低80％,同时伴有这些抑癌基因重新表达[14]。Robert等研究发现无论使用反义核苷酸还是siRNA,选择性敲除DNMT1,均能明显降低结肠癌王HCT116、SW48和SW480细胞内的DNMT的活性,并引起细胞总体甲基化水平下降和抑癌基因CDKN2A的重新表达。Leu等研究发现在抑制卵巢癌CP70细胞生长方面,联合沉默DNMT3b和DNMT1基因对抑制肿瘤细胞的生长作用明显强于单独沉默DNMT3b基因；去甲基化作用方面,联合两种siRNA干扰引起癌细胞去甲基化的作用较明显；单独沉默DNMT3b或DNMT1基因,可以引起TWIST、RASSF1A和HIN-1 mRNA表达升高1-3倍,同时沉默DNMT1和DNMT3b可引起TWIST、HIN-1mRNAs升高7倍,RASSF1A mRNAs升高15倍。认为维持细胞内甲基化的关键酶是DNMT1,DNMT3b只是起辅助DNMT1的作用[15]。Ting等研究发现沉默DNMT1基因后,结肠癌SW48细胞、膀胱癌T24细胞内甲基转移酶的活性明显下降,但细胞内仍维持了DNA高甲基化水平。但乳腺癌T47D用瞬时转染干扰DNMT1 mRNA后,DNMT1蛋白表达明显下降,甲基转移酶的活性降低90％,同时细胞的Cdkn2a、Sfrp1和Gata4基因的启动子发生去甲基化,基因的mRNA明显升高。提示对于维持细胞内甲基化水平,不同的人肿瘤细胞对DNMT1的依赖程度是不同的[16]。Sowińska等构建了稳定表达沉默DNMT1和(或)DNMT3b基因的乳腺癌MCF-7细胞和胰腺癌AsPC1细胞的细胞株,分别干预DNMT1和DNMT3b可引起甲基化水平下降59％、57％、45％和38％,联合干扰两个基因可引起CXCL12启动子CpG岛甲基化水平下降75％和68％,同时发现甲基转移酶抑制剂5-dAzaC可引起CXCL-12启动子CpG岛甲基化水平下降93％和94％[17]。总的来说,DNMTs在多种肿瘤疾病的发生、发展中起了重要的作用,DNMT1和DNMT3b在不同肿瘤疾病中所起的作用不尽相同。目前,DNMTs在胰腺癌中的起所起的作用,以及沉默DNMT1基因对胰腺癌的治疗作用如何的研究甚少。　　 本研究主要通过构建携带DNMT1 RNAi基因的重组杆状病毒载体,并以此进一步研究DNMT1对胰腺癌细胞及相关基因的影响。通过构建携带DNMT1 RNAi基因的重组杆状病毒载体,沉默DNMT1基因观察其对胰腺癌细胞周期及胰腺癌相关基因的影响。本研究分二部分:　　 1、构建携带DNMT1 RNAi基因的重组杆状病毒载体。结果表明重组杆状病毒能够感染PaTu8988,并且能显著干扰DNMT1,DNMT3a和DNMT3b基因表达。　　 2、利用携带DNMT1 RNAi基因的重组杆状病毒载体刺激PaTu8988,观察其对胰腺癌细胞生长情况的影响。结果表明构建的杆状病毒干扰载体能够有效的抑制胰腺癌细胞PaTu8988的增殖。