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目的:涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一,其发病率居涎腺恶性肿瘤的第二位。嗜神经浸润性和易发生血行性转移是涎腺腺样囊性癌的主要特征。其发病机制目前尚不完全清楚,因此有必要以调控细胞周期,诱导细胞凋亡为靶点研究肿瘤细胞凋亡的机制,探索新的治疗方法,提高患者的生存质量和生存率。Caspase的全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶,在细胞凋亡过程中起至关重要的作用。莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)是从十字花科类植物中提取的一种异硫氰酸酯,因其抗肿瘤效果佳而受到广泛关注。Caspase家族成员在肿瘤,缺血再灌注,炎症,组织损伤等过程中参与了多种细胞的凋亡,Caspase是细胞凋亡的中心环节。我们近期的研究表明,SFN可以抑制腺样囊性癌细胞系ACC-M的增殖,并诱导其凋亡。但是在SFN诱导ACC-M细胞凋亡的过程中,Caspase-3,8,9所起的作用,国内外尚未见报道。本实验拟对体外培养的人腺样囊性癌ACC-M细胞经40μM SFN处理后,采用分光光度法检测Caspase-3,8,9在不同时间点的活性的变化。并且采用流式细胞术检测经Caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理后,SFN诱导ACC-M细胞凋亡情况,从而研究Caspase-3,8,9在SFN诱导ACC-M细胞凋亡过程中的作用,探讨其可能的机制,并为临床上治疗涎腺腺样囊性癌提供理论依据。材料和方法:1材料ACC-M:上海交通大学口腔颌面外科实验室提供,建立于1995年;Caspase-3,8,9活性检测试剂盒及广谱Caspase抑制剂Z-VAD-FMK:购自碧云天生物技术研究所;SFN:购自美国LKT实验室,纯度≥98%;细胞凋亡试剂盒(Annexin-V-FITC/PI试剂盒):购自北京宝赛生物技术有限公司。2方法2.1药液配制SFN:用DMSO配制成100μM储存液,-20℃冰箱储存。使用前用RPMI1640培养液稀释。Caspase抑制剂Z-VAD-FMK的配制:将20μL Caspase抑制剂Z-VAD-FMK(20mM)放入4mL DMSO溶液中,配成100μM储存液混匀后适当分装备用。2.2细胞培养:采用加入10%胎牛血清和青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)的RPMI1640培养基,在37℃、5%CO2恒温箱内饱和湿度下培养,当细胞爬满瓶底壁的80%时以0.04%EDTA和0.25%胰蛋白酶(1:1)混合液消化传代。2.3分光光度法检测Caspase-3,8,9活性:先利用pNA标准品制作出pNA浓度相当于A405的标准曲线。取对数生长期细胞制成2.0×105/mL细胞悬液接种于6孔板,继续培养24h后,弃去培养液,每孔加入浓度为40μM的SFN2mL。继续培养0h(对照组)、4h、8h、16h和24h,收集细胞后以PBS洗涤一次,吸尽上清液,按照每20×105个细胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解,离心后收集上清,即为待测样本。分别将10μL待测样本,80μL检测缓冲液,10μLAc-DEVD-pNA(或Ac-IETD-pNA或Ac-LEHD-pNA)置于96孔板中,并设空白对照。将96孔板置于酶标仪上测定A405,通过与A405标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。然后分别绘制以时间为横轴,pNA的量为纵轴的Caspase-3,8,9活性图。2.4流式细胞术检测:实验分三组,先用最终浓度为50μM的Caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理细胞2h,再用40μMSFN处理细胞24小时作为实验组(SFN+Caspase抑制剂组)。以0.04%DMSO处理细胞24小时作为阴性对照组(DMSO组)。以40μMSFN处理细胞24小时作为阳性对照(SFN组)。获取细胞后,Annexin-V-FITC和PI双标记活细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。3统计学分析以上实验均重复三遍,使用SPSS13.0统计学软件,应用单因素方差分析对pNA含量和细胞凋亡率进行统计学分析。结果:1分光光度法检测Caspase-3活性:在SFN诱导ACC-M细胞凋亡过程中,Caspase-3的活性有明显升高,在16小时达到高峰,之后有所下降。经统计学分析,各时间组与空白对照组(0h)相比,均有显著性差异(0h vs4h:P<0.01;0h vs8h: P<0.01;0h vs16h: P<0.001;0h vs24h: P<0.01),各时间处理组之间比较,4h,8h,24h组之间两两比较,无统计学差异,P>0.05。4h,8h,24h组分别与16h组比较,有统计学差异,P<0.05。2分光光度法检测Caspase-8活性:在SFN诱导ACC-M细胞凋亡过程中,Caspase-8的活性有明显升高,在16小时达到高峰,之后有所下降。经统计学分析,各时间组与空白对照组(0h)相比,均有显著性差异(0h vs4h:P<0.05;0h vs8h: P<0.01;0h vs16h: P<0.001;0h vs24h: P<0.01),各时间处理组之间比较,4h,8h,24h组之间两两比较,无统计学差异,P>0.05。4h,8h,24h组分别与16h组比较,有统计学差异,P<0.001。3分光光度法检测Caspase-9活性:在SFN诱导ACC-M细胞凋亡过程中,Caspase-9的活性有明显升高,在16小时达到高峰,之后有所下降。经统计学分析,各时间组与空白对照组(0h)相比,均有显著性差异(0h vs4h:P<0.05;0h vs8h: P<0.001;0h vs16h: P<0.001;0h vs24h: P<0.001),各时间处理组之间两两比较,均有统计学差异(4h vs8h: P<0.001;4h vs16h:P<0.001;4h vs24h: P<0.001;8h vs16h: P<0.001;8h vs24h: P<0.001;16hvs24h: P<0.05)。4流式细胞术检测法:SFN组细胞凋亡明显,DMSO组和SFN+Caspase抑制剂组也有细胞凋亡,但凋亡率低。经统计学分析,SFN组与SFN+Caspase抑制剂组相比,凋亡率有显著差异(P<0.01)。DMSO组与SFN+Caspase抑制剂组相比无统计学差异(P>0.05﹚。结论:1SFN诱导涎腺腺样囊性癌ACC-M凋亡过程中,Caspase-3,8,9的活性均在4小时时即出现增高,并持续到24小时,且在16小时时活性最高。250μMCaspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理细胞2h,能显著抑制SFN诱导的ACC-M细胞凋亡,证明Caspase家族成员在SFN诱导的ACC-M细胞凋亡中起作用。