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目的
青蒿素具有抗疟、抗寄生虫、抗肿瘤等作用。在青蒿素类药物抗肿瘤作用分子机制的研究中,青蒿素类药物不仅能够直接杀伤肿瘤细胞,还通过抑制肿瘤组织血管新生抑制肿瘤生长。此类药物能够阻止血管内皮细胞形成管样结构,抑制鸡胚绒毛尿囊膜模型(CAM)和大鼠主动脉新生血管形成。
血管新生,即从已存在的毛细血管网上,生成大量新生血管的过程。新生血管在创伤、月经周期以及妊娠期通过形成新生血管恢复组织血供,促进创伤愈合、卵泡成熟以及母体与胎儿之间血液交流循环的建立维持机体稳态。血管新生参与多种疾病的发生与发展,是包括肿瘤、糖尿病眼病以及糖尿病肾病、早老性视网膜病变、风湿性关节炎在内的70余种疾病的主要病理特征。全球范围内有5亿人饱受因血管新生导致的疾病困扰。新生血管形成是一系列有序的血管生成过程,包括血管基底膜和细胞外基质的选择性降解、血管内皮细胞的增殖与迁移、血管内皮细胞分化形成毛细血管芽等阶段。因此血管内皮细胞是抗血管新生研究的主要作用靶点,
本课题组前期研究证明,青蒿素类药物中的青蒿琥酯能够抑制碱烧伤诱导的角膜新生血管形成。但青蒿素类药物抑制血管新生的具体分子机制目前仍不清楚。本研究以血管内皮细胞为研究重点,探讨青蒿琥酯抗血管新生作用的具体分子机制,旨在明确青蒿琥酯抑制血管新生的作用分子机制,为临床应用提供实验基础。
结果
1.青蒿琥酯抑制人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells,HUVECs)的增殖
MTT增殖实验分析青蒿琥酯对HUVECs增殖的作用。结果显示,同对照组相比,青蒿琥酯剂量依赖性抑制HUVECs的增殖(P＜0.01.),IC50约为25gmol/L。
2.青蒿琥酯剂量依赖性诱导HUVECs凋亡
Annexin V-PI法标记凋亡细胞,流式细胞仪分析青蒿琥酯对HUVECs凋亡的作用。结果显示,PBS对照组细胞自然凋亡率为5.33％±0.612％,25μmol/L秋水仙素阳性对照组细胞凋亡率为38.98％±1.590％,而12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L青蒿琥酯处理组的凋亡率分别为10.88％4±1.036％、21.7％±0.936％、34.48％±1.216％、47.41％±1.180％。说明青蒿琥酯剂量依赖性诱导血管内皮细胞凋亡(P＜0.01)。
3.青蒿琥酯通过线粒体凋亡通路诱导HUVECs凋亡
DiOC2(3)荧光染料分析线粒体膜电位。结果显示,与PBS对照组相比25μmol/L和100μmol/L青蒿琥酯处理24h后,细胞平均荧光强度分别为对照组的63.20％±5.97％和37.07％±4.35％,说明青蒿琥酯呈剂量依赖性导致HUVECs线粒体膜电位降低。Western blotting分析显示,青蒿琥酯处理HuVEcs24h后,线粒体组分中Bax增多,Bcl-2降低,BaX/Bcl-2比值升高;100μmol/L青蒿琥酯处理后细胞浆内细胞色素C水平增多;而且,青蒿琥酯呈剂量依赖性促进caspase9和caspase3的切割;提示青蒿琥酯通过线粒体凋亡通路诱导血管内皮细胞凋亡。
Western blotting分析结果显示,不同剂量青蒿琥酯处理HuVEcs24h后,死亡受体通路中的关键分子Fas与Fas Ligand的表达水平没有改变,说明青蒿琥酯不通过死亡受体途径诱导血管内皮细胞凋亡。
4.青蒿琥酯通过激活p38 MAPK诱导HUVECs凋亡
(1)青蒿琥酯以时间和剂量依赖性提高HUVECs p38 MAPK的磷酸化水平
Western blotting分析青蒿琥酯处理后HUVECs内MAPK蛋白磷酸化水平的改变,结果显示,青蒿琥酯以时间和剂量依赖性提高HUVECs内p38的磷酸化水平,而对p42/p44 MAPK以及JNK的磷酸化水平具有抑制作用。
(2)p38MAPK激酶抑制剂拮抗青蒿琥酯诱导HUVECs凋亡的作用
Annexin V-PI法分析两种p38 MAPK磷酸化抑制剂SB203580和SB202190对青蒿琥酯诱导HUVECs凋亡的影响。结果显示,SB203580和SB202190均能降低青蒿琥酯诱导HUVECs细胞凋亡的作用。青蒿琥酯组细胞凋亡率为54.90+1.72％,SB203580组细胞凋亡率为24.70±2.68％,SB202190组细胞凋亡率为27.05±6.24％;而且SB203580和SB202190均能抑制青蒿琥酯处理后caspase9的切割。提示青蒿琥酯通过激活p38 MAPK诱导血管内皮细胞凋亡。
5.青蒿琥酯通过产生ROS激活p38MAPK激酶,诱导内皮细胞凋亡
(1)青蒿琥酯显著提高HUVECs中氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平
青蒿琥酯处理10min后,HUVECs中ROS水平即开始升高,4h达高峰,随后逐渐降低,但至24h仍维持较高水平。不同浓度青蒿琥酯分别处理HUVECs2h后,细胞内ROS水平呈剂量依赖性提高(P＜0.01)。
(2)青蒿琥酯以ROS依赖性诱导HUVECs凋亡
ROS清除剂NAC降低青蒿琥酯处理后血管内皮细胞中ROS的水平,抑制青蒿琥酯诱导的血管内皮细胞凋亡,以及caspase9的切割。青蒿琥酯组细胞凋亡率为52.23±2.20％,NAC预处理后凋亡率降至17.63±6.37％。
NAC预处理后,磷酸化的p38 MAPK水平显著降低,说明青蒿琥酯通过产生ROS,激活p38 MAPK,诱导血管内皮细胞凋亡。
(3)青蒿琥酯以亚铁离子依赖性方式产生ROS
预先应用FeSO4提高细胞内亚铁离子浓度或去铁胺(desferrioxamine,DFOM)降低细胞内铁离子浓度,分析青蒿琥酯处理后HUVECs中ROS水平的改变。结果发现,FeSO4具有促进青蒿琥酯产生ROS的作用,DFOM抑制青蒿琥酯产生ROS,说明青蒿琥酯产生ROS是铁依赖性的(P＜0.01)。
Annexin V-PI法与Western blotting法分析铁离子浓度的改变对青蒿琥酯诱导血管内皮细胞凋亡作用的影响发现,FeSO4提高了青蒿琥酯处理后血管内皮细胞凋亡率以及促进细胞内caspase9的切割,而DFOM降低了青蒿琥酯处理后细胞的凋亡率,并减少了caspase9的切割,说明青蒿琥酯以铁依赖性方式诱导血管内皮细胞凋亡。
结论及研究意义
1.青蒿琥酯通过ROS-p38MAPK-线粒体凋亡途径诱导血管内皮细胞凋亡。
2.青蒿琥酯以铁依赖性方式产生ROS,ROS通过激活p38MAPK,启动线粒体凋亡通路,导致HUVECs凋亡。
首次在血管内皮细胞中证明青蒿琥酯对血管内皮细胞的抑制作用同铁与氧自由基密切相关,此发现为证明与铁相关的自由基的产生是青蒿素类药物发挥药理作用的主要分子机制提供了新依据。