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目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对T细胞的免疫调节作用受损,但其具体机制尚不清楚。白介素34(interleukin-34,IL-34)具有调节免疫系统的作用。在本研究中,旨在探讨IL-34对MSCs免疫调节功能的影响。 方法:(1)分离RA患者CD4+T细胞,加入anti-CD3/CD28抗体活化(anti-CD3抗体:3μg/ml;anti-CD28抗体:2μg/ml),同时与IL-34刺激或未刺激的脐带MSCs(MSCs∶CD4+T细胞=1∶10)共培养72小时,收集悬浮细胞,采用流式细胞术检测CD4+CXCR5+ICOS+T细胞和Treg细胞百分率,采用RT-PCR方法检测CD4+T细胞中IL-21、Bcl-6mRNA表达水平,ELISA检测上清中PEDF蛋白水平,收集共培养体系中MSCs,采用RT-PCR检测MSCs中PEDF mRNA表达水平和CD4+T细胞中PEDF mRNA水平;(2)向上述共培养体系中加入anti-CSF-1R抗体,,收集悬浮细胞,采用流式细胞术检测CD4+CXCR5+ICOS+T细胞和Treg细胞百分率,采用RT-PCR方法检测CD4+T细胞中IL-21、Bcl-6mRNA表达水平,收集培养上清,ELISA检测上清中PEDF蛋白水平,收集共培养体系中MSCs,采用RT-PCR检测MSCs中PEDF mRNA表达水平;(3)流式检测MSCs上CSF-1R的表达,在IL-34刺激或不刺激的MSCs中加或不加anti-CSF-1R抗体,分别培养0h、24h、48h、72h,收集MSCs,采用RT-PCR检测MSCs中mRNA的表达水平,收集培养上清,采用ELISA检测PEDF蛋白水平;(4)向IL-34刺激或未刺激的MSCs和活化的CD4+T细胞共培养体系中加入empty pEX-4或PEDF-pEX-4质粒,培养72小时,收集悬浮细胞,采用流式细胞术检测CD4+CXCR5+ICOS+T细胞百分率,采用RT-PCR方法检测CD4+T细胞中IL-21、Bcl-6mRNA表达水平,收集细胞培养上清,采用ELISA检测PEDF蛋白水平,收集MSCs,采用RT-PCR检测MSCs中PEDF mRNA表达水平,采用qPCR检测MSCs中IL-10,IL-6,IDO,TGF-β,HGF和COX-2mRNA表达水平;(5)提取MSCs总蛋白,Western blot检测IL-34刺激前后和及加入IL-34受体拮抗剂后,细胞内Erk1/2、JNK、P38、NF-κB通路的活化,并用相应的信号通路抑制剂处理MSCs,加入IL-34刺激后ELISA检测培养上清中PEDF的水平。 结果:1,与IL-34未刺激的共培养组相比,IL-34刺激的共培养组中CD4+CXCR5+ICOS+T细胞百分率明显升高,Treg细胞百分率明显降低,同时,CD4+T细胞中IL-21and Bcl-6mRNA表达均显著升高,CSF-1R在MSC表面表达,加入anti-CSF-1R抗体可抑制共培养体系中CD4+CXCR5+ICOS+T细胞产生,促进Treg细胞产生,同时,CD4+T细胞中IL-21和Bcl-6mRNA表达均明显下降;2,RT-PCR和ELISA结果均显示,在上述共培养体系和MSCs单独培养体系中,IL-34可在mRNA水平和蛋白水平上抑制MSCs产生PEDF,且PEDF的降低具有一定的时间依赖性,而anti-CSF-1R抗体则可逆转该现象,IL-34刺激或未刺激的MSCs均不表达PEDF;3,流式结果显示,将PEDF-pEX-4转入MSCs中,使其PEDF表达升高,可使共培养体系中CD4+CXCR5+ICOS+T细胞百分率显著下降,CD4+T细胞IL-21和Bcl-6mRNA也明显下调,培养上清中PEDF蛋白水平和MSCs中PEDF mRNA均显著升高,同时MSCs中IL-6mRNA表达明显升高,而COX-2mRNA表达明显降低;4,与未加任何刺激剂的MSCs相比,IL-34刺激MSCs后p-P38,p-NF-κB和p-JNK的表达明显升高,p-ERK1/2的表达没有明显变化,当加入anti-CSF-1R抗体后,p-P38和p-NF-κB表达显著下降,ELISA结果显示,加入信号通路抑制剂检测IKK-16和SB203580后,上清中PEDF蛋白水平明显升高,但加入FR180204和SP600125,PEDF水平没有明显变化。 结论:IL-34刺激的MSCs通过激活P38/NF-κB信号通路分泌低水平的PEDF,导致MSCs IL-6mRNA表达升高,COX-2mRNA表达降低,进而异常调控RA外围血CD4+CXCR5+ICOS+T细胞。