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4-乙酰氧基氮杂环丁酮,化学名称为(3R,4R)-3-[(R)-1-(叔丁基二甲基硅氧基)乙基]-4-乙酰氧基-2-氮杂环丁酮(简称4-AA),是合成青霉烯和碳青霉烯抗生素母核的关键起始原料。而(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯作为4-AA合成的关键手性中间体,现多为化学合成,使用昂贵的金属钌化合物作为催化剂,需要在高温高压条件下进行。因此,开发绿色、高效的(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯立体选择性生物合成技术具有十分重要的理论意义和应用前景。本论文围绕该工艺路线,就生物催化剂的发现、制备与应用等几方面展开研究。论文首先建立了底物2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯及产物2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的高效液相色谱检测方法,并成功实现了产物4种异构体及底物在手性色谱柱上的分离。从土壤及本实验室现有菌株中筛选到一株能不对称催化还原2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯合成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的菌株ZJB-12126,该菌株为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkolderia gladioli)。通过单因素实验对菌株培养基成分及培养条件进行了优化。最佳条件为:果糖10.0g/L,酵母膏30.0g/L,NaCI4.0g/L,发酵初始pH为7.0,装液量50mL/250mL,转速150rpm,接种量2%,培养温度28 ℃,培养时间40 h。在此条件下,最高酶活为31.25 U/L,生物量为9.80 gDCW/L,产物e.e,值为62.70%,较优化前分别提高了 3.99倍,0.79倍及1.46倍。论文对影响酶立体选择性的因素进行考察。结果发现,在体系中添加DMF作为助溶剂,产物e.e.由48.36%提高至62.59%。热处理后产物e.e.值明显提高,以DMF作为助溶剂,45℃热处理5min,e.e.值达81.92%,产率为82.47%。以DMSO作为助溶剂,45℃热处理15 min,e.e.值达 80.51%,产率为 66.26%;处理 60 min,e.e.值达 88.22%,产率为25.25%。论文研究了在水相中的催化反应条件对该羰基还原酶活力和立体选择性的影响,得到了最适反应条件:温度35 ℃,pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液(100 mM),湿菌体量100 g/L,辅助底物葡萄糖5%(w/v),助溶剂DMF 7.5%(v/v),45℃预热处理5 min。当底物浓度为10 g/L时,生物转化24 h,产率达83.81%,e.e.值达84.32%,较优化前分别提高了 47.55%和 64.78%。