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塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)是新发的动物病毒属于小RNA病毒科,由于SVV对神经内分泌起源的肿瘤细胞具有溶瘤效果且对人体无害,被作为溶瘤病毒来治疗人类癌症。近年发现,SVV感染可以引起猪的水疱性疾病(VD),临床症状与口蹄疫(FMD)和其他猪水疱性疾病高度类似。SVV感染的猪经常出现厌食、嗜睡、跛行和水泡病变。该病自2007年首次在加拿大发现,目前呈现散发流行,在我国主要养猪省份都有该病报道,对世界养殖业构成潜在的巨大威胁。作为猪新发的传染病病原,对SVV的病原体特性和致病机制等知之甚少,迫切需要系统开展其病原特性以及其致病机制的研究,解析其病原体特征,阐明其致病机理,为SVV新型疫苗的研发与防控策略制定以及改造安全高效的溶瘤病毒提供科学依据。细胞自噬(autophagy)、应激颗粒的形成(stress granules,SGs)以及细胞焦亡(pyroptosis)均是细胞受到各种压力刺激后的不同应激反应,在维持机体细胞内环境稳定、抵抗病原微生物感染、免疫应答以及疾病的发生发展等中发挥着重要作用。本研究围绕SVV与宿主细胞相互作用进行研究,系统深入探讨了SVV感染以及3C蛋白如何调控细胞选择性自噬,应激颗粒形成和细胞焦亡的分子机制,具体研究结果如下:1.SVV 3C蛋白拮抗选择性自噬的机制研究巨自噬/自噬通过靶向降解病毒蛋白或者病毒和激活宿主免疫反应在抗病毒免疫中发挥着重要作用。SVV和紫外线灭活的SVV感染SK6细胞后,LC3-I和LC3-II的比值变化等检测结果表明,SVV感染SK6细胞后能够诱导细胞自噬发生,而且依赖于病毒在宿主细胞内的复制过程。在选择性自噬过程中,选择性受体蛋白SQSTM1/p62(sequestosome 1)扮演着重要角色,它能作为一种受体靶向泛素化蛋白或病原体到自噬小体中进行降解。我们首先评价了SQSTM1对SVV增殖的影响,结果显示过表达SQSTM1能降低病毒蛋白的表达和病毒滴度,而下调SQSTM1的表达能促进病毒蛋白的表达和病毒滴度。分子机制研究表明:SQSTM1能与SVV VP1和VP3发生相互作用且不依赖于其UBA域;SQSTM1将SVV VP1和VP3靶向吞噬小体进而降解达到抑制病毒的复制。如此同时,病毒也进化出拮抗宿主的抗病毒策略利于自身的增殖。进一步研究显示SVV 3C蛋白能在E355、Q392和Q395三个位点切割SQSTM1,使被切割后的SQSTM1失去了介导选择性自噬和抑制SVV增殖的能力。我们的结果表明宿主通过选择性自噬抑制SVV的增殖,而病毒同时通过其3C蛋白切割SQSTM1的策略逃避宿主的自噬机制进而有利于自身增殖甚至成功感染致病。2.SVV 3C蛋白抑制应激颗粒形成的机制研究应激颗粒(SGs)是细胞应对外界刺激和病毒感染时,细胞产生的一种防御性措施。SGs是m RNA储存的场所,其与调节m RNA的翻译相关,它是响应各种环境压力和病毒感染的动态结构。在本研究中,首先评价了SVV感染293T细胞是否诱导SGs的形成,免疫荧光结果显示SVV感染4 h后,SGs的标志蛋白G3BP1和e IF4G形成点状聚集物的细胞比例达到50%(P<0.01),然后随着感染时间的延长这种点状聚集物逐渐减少,可见病毒感染早期能够诱导SGs的形成而感染晚期抑制SGs的形成。进一步研究表明SVV感染诱导形成的SGs类似于经典的SGs。接下来深入探讨了SVV感染诱导SGs形成的分子机制。SVV在感染早期通过激活PKR-e IF2α信号通路诱导SGs的形成,尽管下调SGs标志蛋白G3BP1能够抑制SGs的形成,但抑制瞬时SGs的形成对SVV增殖没有明显的影响,而下调G3BP1的表达却可以显著减弱NF-κB信号通路的激活。此外,发现SVV在感染后期能够抑制亚砷酸钠(SA)诱导的SGs形成,3C蛋白能够同时抑制SA、poly I:C和热刺激诱导的SGs形成,且3C蛋白的蛋白酶活性是其抑制SGs的形成所必需的。进一步研究显示,SVV感染或者过表达3C蛋白可以破坏e IF4GI-G3BP1相互作用来抑制SGs的形成。3.SVV 3C蛋白诱导细胞焦亡的机制研究细胞焦亡是一种炎症性程序性的细胞死亡,其特征是质膜上的形成孔和细胞肿胀。通过形态学观察和猪源GSDMD(p GSDMD)切割等方法,发现SVV感染SK6细胞后可以诱导caspase依赖性和非依赖性方式的细胞焦亡。进一步研究表明3C蛋白能够在Q193和Q277两个位点切割p GSDMD而且依赖于3C蛋白的酶活性,并且Q277接近于caspase-1诱导的p GSDMD切割位点。通过过表达3C蛋白切割p GSDMD产生的各个片段发现p GSDMD1-277能诱导细胞死亡且细胞形态与细胞焦亡非常相似,其他片段对细胞活性没有明显影响。此外,3C蛋白不能切割鼠源GSDMD和人源GSDMD。而且在293T细胞中过表达p GSDMD能将3C蛋白诱导的细胞凋亡向细胞焦亡转化。总之,本研究揭示了一种由病毒蛋白酶切割GSDMD产生的新的细胞焦亡激活方式,这可能为SVV的发病机制和癌症治疗提供重要的见解。总之,本研究系统研究了SVV感染以及3C蛋白在调控细胞选择性自噬、应激颗粒形成以及细胞焦亡的分子机制。本研究结果为深入阐明SVV与宿主细胞相互作用和致病机制奠定基础,为SVV新型疫苗和溶瘤病毒等生物制剂的研发提供理论依据,也丰富了小RNA病毒调控细胞应激反应的研究内容。