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病原菌侵染宿主过程中将面临宿主免疫反应产生过量活性氧的胁迫,即氧化胁迫,病原菌则会启动一系列抗氧化胁迫的策略应对氧化胁迫,即氧化胁迫反应。生物体的氧化胁迫反应策略复杂且多样,包括一些转录因子的直接参与或间接调控作用。在真核生物中存在一种固醇调控元件结合蛋白SREBPs(Sterol Regulatory Element Binding Proteins),主要负责调控固醇的动态平衡,包括脂肪酸以及胆固醇的合成等生物学过程。在真菌中,这类蛋白除了保守功能外,还参与部分真菌的低氧适应性。课题组前期研究发现,昆虫病原真菌球孢白僵菌SREBPs蛋白BbSre1不仅参与菌株低氧适应性,还与菌株氧化胁迫反应密切相关。基于此,本论文聚焦BbSre1介导病原菌氧化胁迫反应,结合基因敲除和超量表达、染色质免疫共沉淀和比较转录组分析等方法,在明确BbSre1与氧化胁迫反应和侵染致病的基础上,探究BbSre1调控白僵菌氧化胁迫反应的分子基础。主要研究结果如下:1.氧化胁迫促进BbSre1进入细胞核BbSre1编码989个氨基酸,蛋白N端是高度保守的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)亮氨酸锌指DNA结合域,其中包含一个保守的与固醇调控元件(SRE)结合的酪氨酸残基。利用融合GFP标签分析BbSre1亚细胞定位,发现GFP荧光信号分布在细胞质和细胞核,但随着氧化胁迫时间的延长,GFP信号进入细胞核的比例增加。由此推测,氧化胁迫促进BbSre1进入细胞核,可能参与氧化胁迫相关基因的转录调控。2.BbSre1介导球孢白僵菌生长和分生孢子萌发为探究BbSre1与菌株发育分化的关系,在基因敲除菌株(ΔBbSre1)的基础上,分别构建了回复互补菌株(Comp)和超量表达菌株(BbSre1OE)。在基础培养基(CZA)和富营养培养基(1/4 SDY和PDA)上,敲除BbSre1显著削弱了菌株生长和分生孢子萌发速率,但不影响分生孢子产生,而超量表达菌株(BbSre1OE)生长和孢子萌发与野生菌株WT无明显差异。由此表明,BbSre1介导菌株生长和分生孢子萌发。3.BbSre1参与菌株氧化胁迫反应为验证BbSre1与白僵菌氧化胁迫反应的关系,测定了基因破坏和超量表达对菌株氧化胁迫敏感性的影响。结果表明,破坏BbSre1增强了菌株对氧化剂H2O2和Menadione(MND)敏感性,而过表达菌株的氧化胁迫敏感性与野生菌株无明显差异。为解析ΔBbSre1氧化敏感性增强的生理学基础,分别测定了菌株在正常和氧化胁迫条件下抗氧化酶活性和抗氧化酶相关基因的转录模式,结果表明,无论在正常或H2O2胁迫条件下,ΔBbSre1的抗氧化酶活性均低于WT和Comp,并且部分抗氧化酶基因表达显著下调。该结果表明BbSre1影响抗氧化酶活性和抗氧化酶相关基因的表达。4.BbSre1调控球孢白僵菌氧化胁迫反应的分子基础为探究BbSre1调控球孢白僵菌氧化胁迫反应的分子基础,利用染色质免疫共沉淀和比较转录组分析了BbSre1调控的靶标基因。结果表明,在正常条件下共有108个BbSre1调控的靶标基因,其中包括60个上调基因和48个下调基因。在H2O2胁迫下鉴定到18个BbSre1靶标基因,包括11个上调基因和7个下调基因。在MND胁迫下鉴定到305个BbSre1靶标基因,包括137个上调基因和168个下调基因。GO富集表明,在正常条件下,BbSre1调控的靶标基因主要富集在乙醇脱氢酶活性(alcohol dehydrogenase activity)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)和磷酸转移酶活性(phosphotransferase activity)等功能类别;在氧化胁迫条件下,BbSre1调控的靶标基因主要富集在氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)、膜的固有成分(intrinsic component of membrane)和肉桂酸还原酶活性(cinnamate reductase activity)等功能类别。由此表明,BbSre1主要通过控制细胞发育分化、膜成分、氧化还原酶活性以及解毒等相关靶标基因的转录,调控白僵菌的氧化胁迫反应。5.敲除BbSre1降低病原菌的毒力鉴于BbSre1介导菌株生长、萌发和氧化胁迫反应,推测BbSre1参与球孢白僵菌毒力的调控,因此通过体壁侵染和微量注射两种方式测定了BbSre1基因敲除和超量表达对菌株毒力的影响。结果表明,敲除BbSre1导致菌株对大蜡螟幼虫的致死率显著降低且菌丝穿出僵虫体壁的速率也明显滞后,而超量表达菌株与野生菌株的毒力无明显差异。进一步分析发现,ΔBbSre1在昆虫血腔易被血细胞包裹且发生明显的“黑化”反应,其虫菌体增殖速率明显低于WT,而虫体血细胞数量则高于野生菌株处理。由此表明,BbSre1介导菌株毒力和逃避宿主免疫反应。论文研究结果表明,固醇调控元件结合蛋白BbSre1调控氧化还原、膜成分解毒代谢等基因的转录,介导球孢白僵菌氧化胁迫反应,影响菌株侵染致病逃避宿主免疫反应。