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垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)是血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide, VIP)/促胰液腺素/胰高血糖素/生长激素释放激素家族的一员,与VIP有68%的同源性。同VIP一样,PACAP是一种多效性多肽,其生物学功能涉及机体9大系统,而且对糖尿病、肥胖、高血压、哮喘、帕金森等疾病的治疗有一定的积极作用。然而,PACAP的体内半衰期较短(约5-10min),且目前针对这一问题的研究较少,并都需要进行体外化学修饰,操作繁琐、所得衍生物活性受限。因此,本研究对PACAP的氨基酸序列进行改造,在其羧基端末尾添加半胱氨酸,拟使其能与机体血清白蛋白结合,抑制可能存在的降解行为,提高体内稳定性；并用基因工程技术制备PACAP及其衍生物,降低研究成本；此外,本研究还通过动物实验和细胞实验初步探究了PACAP及其衍生物在抗肥胖、抗肿瘤和降血糖方面的活性。本研究的主要内容和结果概述如下：1) PACAP及其衍生物的克隆、表达、纯化对GenPept报道的PACAP(包括PACAP38和PACAP27)的氨基酸序列进行改造,将改造衍生物命名为cPACAP (cPACAP38和cPACAP27);人工合成cPACAP38的碱基序列后,PCR扩增PACAP38、PACAP27和cPACAP27的基因序列；为使目的多肽与硫氧还蛋白(Trx)融合表达,采用克隆技术将目的基因插入表达载体pET32a(+)中,获得4种表达质粒后分别转化表达宿主菌BL21(DE3),得到4种表达菌株——BL21-pET32a(+)-PACAP38、BL21-pET32a(+)-cPACAP38、BL21-pET32a(+)-PACAP27、BL21-pET32a(+)-cPACAP27。表达菌株经IPTG诱导后表达融合蛋白,共4种——Trx-PACAP38、Trx-cPACAP38、Trx-PACAP27、Trx-cPACAP27,其表达量分别为22.1%、24.6%、47.3%、47.7%,可溶性融合蛋白占表达量的百分比分别为48.7%、54.0%、88.3%、66.6%。将IPTG诱导表达的菌液超声破碎后,经两次镍离子螯合亲和层析,得到4种目的多肽——PAC AP38、cPAC AP38、PAC AP27、cPAC AP27,得量分别为1.6mg、1.8mg、9.1mg、5.7mg, ImageJ软件扫描纯度均在95%以上。2) PACAP及其衍生物的活性测定与比较采用小鼠饮食抑制实验,对基因工程制备的PACAP及其衍生物进行活性测定和比较。结果表明,不同剂量的4种目的多肽对小鼠饮食均有抑制作用,而且cPACAP38与cPACAP27的活性明显比PACAP38与PACAP27强,cPACAP38的效果能持续12h仍有显著性差异,cPACAP27也能维持12h有统计意义。表明与天然PACAP相比,衍生物cPACAP的体内活性更稳定、效果更持久。3) PACAP及其衍生物生物学活性探究长期给药观察PACAP38及cPACAP38的抗肥胖效果。连续10天给小鼠腹腔注射PACAP38和cPACAP38,结果显示,小鼠体重、糖耐量及体内肥胖相关指标如甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和胆固醇等并没有明显变化。用MTT比色分析法检测不同浓度PACAP27和cPACAP27对人乳腺癌细胞Bcap37、人肝癌细胞BEL7404、人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人肺癌细胞A549增殖活性的影响,结果未显示出调控作用。用腹腔糖耐量及降糖药效法分析PACAP27和cPACAP27对GLP-1降糖活性的影响。发现,将PACAP27及cPACAP27与GLP-1混合后给小鼠注射,其降糖效果更明显,给药剂量为1 Onmol/kg时,混合给药组的降糖效果能持续1.5h,是单独GLP-1给药组的3倍,提示PACAP对GLP-1的降糖活性有辅助作用。通过以上研究,得到4种基因工程表达菌株,获得了体内生物学活性更稳定、效果更持久的PACAP衍生物(cPACAP38和cPACAP27),并通过小鼠体内实验证明了PACAP对GLP-1降血糖效果的辅助作用,为PACAP的进一步理论和应用研究奠定基础。