论文部分内容阅读
本研究利用前期研究中构建的pGEX-BgTX(P22-A31)质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化后得到了较纯的重组α-银环蛇毒素同工毒素，得率约为1.225mg/L。用重组蛋白与天然α-银环蛇毒素的抗原性一致。重组α-银环蛇毒素同工毒素的半致死剂量LD50为1.598mg/kg，约为天然α-银环蛇毒素的1/5且有一定的镇痛药效，1/4LD50剂量的镇痛百分率为55-2％，1/8LD50剂量的镇痛百分率为20.5％，在外周镇痛作用中呈一定的量效关系。以上结果表明，本研究重组表达的α-银环蛇毒素同工毒素(P22-A31)具有与天然α-银环蛇毒素相似的生物学活性。
α-银环蛇毒素cDNA序列的多态性及其引起这种多态性的原因一直存在争议。本文从同一银环蛇个体中克隆并测序了5个α-银环蛇毒素基因组序列，又在同一次反转录的cDNA中克隆神经生长因子的cDNA，并通过计算多个克隆间的突变情况，与同一体系中得到的12种α-银环蛇毒素cDNA序列突变率做比较，并统计了前人克隆到的多种α-银环蛇毒素cDNA序列突变的情况，得出结论：α-银环蛇毒素cDNA序列的多态性不是由于基因组不同而来的，也不是由RNA编辑造成，很可能是由于反转录过程，PCR，基因克隆及DNA测序过程人为引入的。
运用RACE技术从银环蛇毒腺cDNA中克隆到2个C型凝集素基因的全长cDNA序列，BML-1和BML-2，其中BML-2是首次从银环蛇(Bungarusmulticinctus)中克隆到。并将这2个蛋白135个氨基酸的成熟肽部分和137个氨基酸的成熟肽部分分别连入pET-His载体后在BL21(DE3)plysS中表达，重组蛋白以包涵体的形式存在，复性后的重组C型凝集素具有凝集红细胞活性。其中由135个氨基酸组成的重组C型凝集素以单体形式存在，由137个氨基酸组成的重组C型凝集素有50％以二聚体的形式存在，另50％以单体形式存在。Westernblotting和亲和纯化结果表明，天然C型凝集素是以更小分子量的单体形成的二聚体。纯化到的4种分子量不同的蛋白中14.4KD左右的蛋白可以形成二聚体，认为是目的蛋白。银环蛇C型凝集素基因的克隆和表达研究对对阐明银环蛇蛇毒中C型凝集素的性质、组成及其功能起到重要的作用。