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目的本研究以纳豆联合红曲为干预物,观察其对酒精暴露大鼠肝损伤的改善效果,并初步探讨其可能的作用机制。方法1.动物模型建立及分组:8周龄SPF级雄性Wistar大鼠48只,适应性喂养1周后,按体重随机分成4组:正常对照组,生理盐水灌胃;模型组,56°红星二锅头灌胃,6m L/kg 1周+8 m L/kg 1周+10 mL/kg 1周+11 m L/kg 7周;纳豆联合红曲干预组,纳豆红曲(含595.59 FU/kg纳豆激酶,4.46 mg/kg洛伐他汀)灌胃,1小时后酒精灌胃;甘利欣干预组,200 mg/kg甘利欣灌胃,1小时后酒精灌胃。两干预组酒精的灌胃剂量同模型组,实验持续10周。大鼠末次灌胃后禁食不禁水12 h,3%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血,分离血清用于生化指标检测;快速留取新鲜大鼠肝脏及小肠组织,部分用于组织病理学观察和透射电镜超微结构观察,剩余部分于-80℃冰箱冻存待测。2.采用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,H&E)对大鼠肝脏和小肠组织病理学进行观察,采用透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)对大鼠肝脏和小肠组织超微结构进行观察。3.采用全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(Glutamic pyruvic transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase,AST)、谷氨酰转肽酶(Glutamyl transpeptidase,GGT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。4.采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠血清内毒素含量。5.采用蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测各组大鼠肝组织中Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)、CD14(cluster of differentiation-14,CD14)和肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)蛋白表达水平。结果1.纳豆联合红曲对酒精暴露大鼠肝脏组织病理学的改变H&E染色结果显示,正常对照组大鼠肝小叶结构完整,肝细胞索围绕中央静脉以放射状整齐排列,胞浆充盈;模型组大鼠肝小叶界限模糊,肝细胞索排列紊乱,胞浆皱缩并伴有弥漫性胞浆空泡及脂肪变性,汇管区可见大量炎性细胞浸润;纳豆红曲干预组和甘利欣干预组,上述肝组织病理变化明显减轻。TEM观察结果显示,正常对照组大鼠肝细胞核呈圆形或椭圆形,核膜完整清晰,粗面内质网排列整齐,核糖体丰富;模型组大鼠肝细胞核皱缩变形,线粒体肿胀破裂,粗面内质网断裂且排列紊乱,核糖体出现脱颗粒现象;纳豆红曲和甘利欣干预后,上述肝组织超微结构变化得到明显改善,且纳豆红曲组改善效果低于甘利欣组。2.纳豆联合红曲对酒精暴露大鼠小肠组织病理学的改变H&E染色结果显示,正常对照组大鼠小肠绒毛完整且排列整齐,黏膜下腺体形态均匀,无炎性细胞浸润;模型组大鼠小肠绒毛破损脱落,排列紊乱,黏膜下腺体萎缩,可见炎性细胞浸润;纳豆红曲组和甘利欣组上述病理变化得到明显减轻。TEM观察结果显示,正常对照组小肠微绒毛细长丰富,细胞连接紧密清晰;模型组大鼠小肠微绒毛短小稀疏,可见萎缩脱落,紧密连接肿胀,桥粒数量减少;纳豆红曲和甘利欣干预后,上述超微结构变化得到不同程度的改善。3.纳豆联合红曲对酒精暴露大鼠肝脏功能的影响结果显示,与正常对照组相比,模型组大鼠血清ALT、AST、GGT、ALP活性显著升高(P<0.05);干预物补充后,酒精诱导的大鼠血清AST、GGT、ALP活性升高明显受到抑制(P<0.05);且两干预组间上述酶活性比较无显著性差异。4.纳豆联合红曲对酒精暴露大鼠血清内毒素水平的影响ELISA检测结果显示,与正常对照组相比,模型组大鼠血清内毒素水平明显升高(P<0.05);干预物补充后,大鼠血清内毒素水平明显下降(P<0.05);且两干预组间血清内毒素水平比较无显著性差异。5.纳豆联合红曲对酒精暴露大鼠肝组织炎症相关蛋白表达水平的影响Western blot结果显示,与正常对照组相比,模型组大鼠肝组织TLR4、CD14和TNF-α蛋白表达水平明显上调(P<0.05);干预物补充后,TLR4、CD14和TNF-α蛋白表达受到明显抑制(P<0.05);且两干预组间上述蛋白表达水平比较无显著性差异。结论1.一定量的酒精摄入可导致大鼠肝损伤的发生。2.纳豆联合红曲干预可对酒精暴露大鼠肝损伤发挥保护作用。其作用机制可能与纳豆红曲修复肠黏膜屏障,减少内毒素肠渗漏,下调肝组织中TLR4、CD14和TNF-α等炎症相关蛋白表达水平有关。