病毒衣壳介导重编程因子导入新技术

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诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是通过导入特定的转录因子将分化的细胞重编程为具有高度分化潜能的干细胞。它的出现避免了干细胞研究领域的免疫排斥和伦理道德等问题,是生命科学领域的一次革命性进步。但现有的重编程技术所采用的外源基因导入方法还存在安全性和可控性等问题,因此发展低毒、高效可控的基因导入技术是十分紧迫和必要的。基于猴病毒40(Simian virus40,SV40)病毒衣壳的导入载体已经被广泛研究和应用。本研究利用SV40病毒衣壳作为基因导入载体,探索了病毒衣壳介导的重编程因子导入方法,为获得诱导性多能干细胞提供了新思路。   本研究首先构建了SV40病毒衣壳体外包装体系。操纵VP1体外自组装包装外源基因,经透射电子显微镜表征发现,SV40病毒样颗粒大小均一,直径约40 nm,且稳定性良好。通过凝胶阻滞实验、VP1与DNA相互作用,以及超速离心分离等鉴定,证实VP1能够稳定结合外源DNA,并且能够完整的将外源基因包装到病毒样颗粒内部。之后,利用SV40病毒衣壳转导外源基因,包装了荧光标记质粒(pEGFP-Actin)的SV40 VLPs“侵染”细胞,能够观察到质粒入胞及EGFP报告基因的表达,成功建立了基于SV40病毒衣壳的基因转导体系。在此研究基础上,利用SV40 VP1包装四种重编程因子(Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc),获得包装了重编程因子的病毒样颗粒,将其“侵染”细胞。通过质粒荧光标记、特异基因的PCR检测、荧光蛋白表达、免疫荧光和Western blot分析等技术方法详细表征和研究了VP1介导重编程因子进入细胞的过程。综上,本研究建立了SV40病毒衣介导的外源基因转导方法,制备了SV40病毒衣壳包装iPS重编程因子的病毒样颗粒,初步建立了重编程因子导入新技术,为开发病毒衣壳介导获得iPS新技术打下了基础。
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