及时地对环境信息做出合适的行为反应是动物在进化过程中获得的一项基本能力,其中一个很重要的方面就是动物基于过去新近感觉经验,提炼出规律,进而根据这个规律来预测即将到来的感觉信息。这种预测对动物的认知、决策以及行为调整都有重要的影响。比如,对于那些能稳定诱发动物行为反应的感觉信息,在连续间隔相同时间的一串刺激过后,动物通常会在相应的时间点上继续之前的行为应答。此外,患有精神分裂症、焦虑症等精神心理疾病的病人,他们的预测能力不论在脑活动的表现上,还是神经心理的检测上都表现出不足。然而,对于哪些神经环路和脑区是编码预测信号和产生预测行为所必须的,我们几乎还一概不知。而这些信息也许能揭示出一些他们所患疾病的神经病理机制。虽然对于编码即时感觉刺激的新皮层神经环路的研究已经有许多,但这些环路在预测即将到来的感觉信息当中的作用却还知之甚少。因此,我们用在体双光子细胞成像技术、光纤记录技术和光遗传兴奋抑制技术对小鼠初级听觉皮层的活动进行了记录和操控,试图解析其活动在预测信号和预测行为产生中所起的作用。研究目标:1.探测一连串规律声音刺激后,初级听觉皮层的预测信号及其行为学表征;2.观测初级听觉皮层节律性声音预测信号与小鼠预测行为之间的因果关系;3.探索听觉丘脑在小鼠节律性声音预测行为产生中是否必须。研究方法:1.初级听觉皮层双光子钙成像我们使用高敏感度的荧光钙离子指示剂Cal-520酯类分子来标记初级听觉皮层,使得皮层内某一区域的细胞群体被标记上钙染料。钙染料注射后一个小时即可进行双光子成像,且能持续长达8个小时。在整个实验过程中,小鼠的体温被保持在36.5–37.5°C。对头部固定的清醒小鼠进行双光子成像实验之前,小鼠需要先被训练以适应头部固定的方式,训练时间为3-5天。2.行为学任务我们发展了一个简单的声音与舔水行为相偶联的行为学任务。在每次声音刺激(白噪音,76分贝,时长100毫秒)过后100毫秒,实验系统都会提供时长为20毫秒的水。小鼠在训练的过程中需要学会在声音刺激和水供之间建立联系,进而能够在听到声音后一段很短的时间内进行舔水行为。当小鼠的这种偶联反应成功率超过80%,则被视为训练成功,用于实验。3.光纤与行为学同步记录记录光纤放置在皮层硬脑膜表面,并用牙科水泥固定于颅骨。为了激活荧光染料分子(OGB-1 AM),光纤尖端处会持续的发射出微弱激光。并且,被激发出来的荧光也是被同一根光纤收集,最后通过钙信号表现出来。同时,小鼠的舔水行为会被红外相机(采样率:30 Hz)同步记录下来。4.光遗传学激活和抑制在进行光遗传学实验之前,兴奋性的转基因动物Thy1-ChR2-YFP或者注射了光遗传学相关的病毒的动物需要先进行行为学训练。实验时,在麻醉状态下,两根光纤被置于小鼠双侧听觉皮层的第5层或者内侧膝状体表面。麻醉过后至少两小时再开始进行小鼠行为学实验。光刺激由473纳米的蓝光或者593纳米的黄光组成,时长100毫秒。每次光刺激过后100毫秒,实验系统都会提供时长为20毫秒的水。研究结果:1.听皮层神经元节律性声音预测信号的检测1.1在麻醉和清醒状态下,听皮层第2/3层神经元节律性声音预测信号的检测我们首先用钙染料Cal-520 AM对初级听觉皮层第2/3层神经元进行双光子钙成像实验,观测神经元的钙活动。对单个神经元同步的电生理和钙活动记录表明,在我们的实验条件下,钙染料Cal-520 AM能够以接近100%的成功率反映出神经元的单个动作电位发放。进而我们在一连串规律白噪音刺激(时长100毫秒,声强76分贝,刺激间隔2秒)之前,之中和之后都记录了清醒或麻醉小鼠的初级听觉皮层第2/3层神经元的钙活动。我们发现在最后一次声音刺激过后,在与之前声音刺激相应的时间间隔点,大约15%(麻醉状态)或者21.5%(清醒状态)的神经元会再活动一到三次,就像仍有声音刺激一般(实际没有)。我们将此类在期待的时间点产生的活动称为“回声响应”。将声音刺激的间隔改为4秒后,仍有部分神经元表现出回声响应。与此相反的是,当将声音刺激的时间间隔变得不固定(2秒和3秒交替变化)之后,神经元的回声响应消失。除了2秒和4秒的时间间隔外,我们还测试了间隔为1秒,3秒,6秒和10秒的声音刺激。我们发现间隔为3秒时,一连串的声音刺激能引发出部分神经元的回声响应,而间隔为1秒,6秒和10秒的声音刺激这不能。另外,除了白噪音刺激外,我们还测试了纯音刺激。我们发现我们所测试的不同声强的所有纯音都能引发回声响应,表明回声响应的发生不依赖于特定的声音类型和声强。并且,我们还分别测试了数目为5次,10次或30次的声音刺激,发现声音刺激的数目至少要为10次才能引发回声响应。总之,在麻醉和清醒状态下,初级听觉皮层第2/3层神经元都存在节律性声音预测相关信号。1.2.听皮层第5层和第4层神经元节律性声音预测信号的检测为了实现对深层神经元的清晰成像,我们通过仅在脑区深部注射钙染料的方式来减少浅层神经组织的荧光。钙成像实验局限于初级听觉皮层第5层神经元,我们发现约33.5%的第5层神经元在一连串间隔2秒的声音刺激后表现出了回声响应。我们接着观测了初级听觉皮层第4层共13个动物1934个神经元,我们发现仅有约8%的神经元在一串规律声音刺激后表现出了回声响应。2.听皮层节律性声音预测性信号的行为学表征为了探索小鼠初级听觉皮层预测信号的行为学表征,我们发展了一个简单的声音与舔水行为相偶联的行为学任务。训练成功的小鼠会在每次声音刺激(白噪音,76分贝,时长100毫秒)过后一段很短的时间内进行舔水行为。于是我们用一串间隔相同时间的白噪音刺激(间隔3秒或4秒,10次)来进行行为学测试。我们发现在声音刺激结束后相应的时间间隔点(3秒或4秒),所有小鼠都会再多舔水一次,出现了预测性舔水行为,即回声舔水反应。与初级听觉皮层细胞水平上的回声反应相类似,五次连续的声音刺激不能引发回声舔水反应。于是我们同步记录了初级听觉皮层的钙信号和小鼠的舔水行为,同时作为对照,我们也同步记录了尾侧体感皮层的钙信号。我们发现98%±1%的声音本身引发的舔水行为和84%±7%的预测性回声舔水行为与初级听觉皮层的钙信号相关。与之相对应的是,初级听觉皮层94%±4%的声音反应和88%±2%的回声反应与小鼠对声音本身的舔水反应和预测性回声舔水反应相关。根据信号检测理论分析,大约80%的回声舔水反应能够被初级听觉皮层的回声反应准确预测。相反,尾侧体感皮层的钙信号与声音引发的舔水行为和预测性舔水行为都没有相关性。因此,小鼠的预测性回声舔水行为与初级听觉皮层预测信号高度相关。3.听皮层活动在节律性声音预测性行为中的关键作用研究3.1.光遗传抑制初级听觉皮层导致小鼠节律性声音预测行为被抑制为了验证初级听觉皮层的活动在产生预测性回声舔水反应中的必要性,我们进行了两种不同的光遗传抑制实验。第一种方式是我们通过兴奋光激发的外向质子泵古紫质(ArchT)将听觉皮层的兴奋性神经元的活动进行抑制。与对照组相比,抑制组小鼠的回声舔水行为显著减少,仅仅略高于自发舔水的发生率。第二种方式则是利用重组酶系统特异性的使得初级听觉皮层内小清蛋白阳性的抑制性神经元表达二型离子通道视紫质(ChR2),进而通过兴奋这些小清蛋白阳性神经元来达到抑制初级听觉皮层的活动。同样,抑制组小鼠的回声舔水行为显著减少,几近于自发舔水的发生率。因此,初级听觉皮层的活动对于小鼠预测性回声舔水反应而言是必须的。3.2.光遗传兴奋初级听觉皮层可诱发小鼠的节律性声音预测行为我们接着测试了是否直接兴奋初级听觉皮层就能触发小鼠的舔水行为。因为初级听觉皮层第5层是主要的输出层,并且前面的实验也证实了第5层神经元存在回声反应。因此我们在第5层神经元特异性表达二型离子通道视紫质(ChR2)的转基因小鼠中进行了实验。对于训练过的转基因小鼠,用蓝色激光双侧激活初级听觉皮层第5层即可替代声音刺激触发小鼠的舔水行为,而对于未训练的转基因小鼠或者训练过的野生型小鼠则都没有效果。重要的是,在一串连续规律的蓝色激光刺激后,训练过的转基因小鼠出现了预测性回声舔水行为。在部分小鼠中,我们同步刺激(第5层)并记录初级听觉皮层的活动,以及小鼠的舔水行为。我们发现由蓝色激光刺激引起的舔水行为和预测性回声舔水行为都与初级听觉皮层的活动高度相关。另外,我们也测试了第二种兴奋听觉皮层的光遗传手段:注射兴奋性光遗传学病毒到初级听觉皮层。同样的,激光刺激引发的初级听觉皮层兴奋触发了小鼠的舔水反应和预测性回声舔水反应。总之,这些结果表明通过光遗传的方式兴奋一部分初级听觉皮层的神经元即可触发小鼠的预测性回声舔水反应。4.节律性声音预测性行为不依赖于听觉丘脑的活动用光纤记录群体细胞钙信号的方式,我们在听觉丘脑腹侧和背侧均记录到稳定的对声音的反应。而当在一串间隔4秒的规律声音刺激后,听觉丘脑的这两个亚区都没有显示出回声反应。我们又进一步用光遗传抑制的方式在声音刺激后八秒抑制了双侧听觉丘脑的活动,发现对小鼠的回声舔水行为的发生没有显著性影响。因此,我们的结果表明,听觉丘脑的活动对于小鼠回声舔水行为的产生不是必须的。研究结论:1.初级听觉皮层第2/3,第4和第5层神经元编码节律性声音预测信息;2.初级听觉皮层的节律性声音预测信息是产生节律性声音预测行为的关键;3.听觉丘脑对于节律性声音预测行为的产生不是必须的。