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目的:1、探讨雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)及其磷酸化激活形式p ERα-S118在小鼠1-细胞胚和2-细胞胚中的阶段特异性表达与小鼠合子型基因激活的关系。2、探讨ERα特异性抑制剂MPP处理对小鼠植入前胚发育的阶段特异性影响,及其对合子型基因激活的作用机制。3、探讨ERα通过micro RNA途径影响小鼠合子型基因激活的机制,并研究其对干细胞关键因子Oct4和Sox2的调控作用。方法:1、采用输卵管冲洗的方式,于hCG注射后15 h~54 h每隔3 h收集小鼠植入前胚,利用细胞免疫荧光技术检测ERα和p ERα-S118的表达定位。2、收集昆明小鼠1-细胞胚、2-细胞胚和4-细胞胚,以空白KSOM培养液(单纯型优化的胚胎培养基)为对照组,以KSOM中添加MPP为实验组;将各时间点收集的植入前胚培养3 h后再移入新KSOM培养液中继续培养至囊胚阶段,并记录囊胚数。于hCG注射后21 h收集小鼠1-细胞胚,置于MPP中培养,于hCG后27 h,提取总RNA,RT-q PCR检测合子型标志基因e IF1A和Mu ERV-L的表达变化;采用细胞免疫荧光技术检测经21~27 h MPP处理后,组蛋白甲基化(H3K4me3和H3K27me3)水平的改变。于hCG注射后21 h收集小鼠1-细胞胚,分别置于KSOM+BrdU和KSOM+MPP+BrdU培养液中培养,于hCG后27 h收集样品,采用抗BrdU抗体免疫染色实验观察DNA复制情况;于hCG注射后27h收集小鼠1-细胞胚,经不同浓度MPP处理后,于hCG后42 h固定细胞,用免疫荧光技术观察2-细胞胚核像的变化;并且用BrdU掺入法检测DNA复制是否受到影响;采用免疫荧光技术检测S期启动相关因子c-MYC和E2F1的表达变化。3、于hCG注射后27 h收集小鼠1-细胞胚,建立27~45 h MPP处理(20μmol/L)实验组和KSOM对照组模型;提取总RNA,经Megaplex逆转录以及预扩增后,进行Taq Man定量PCR芯片检测,收集数据;通过交集分析,筛选出差异表达的micro RNA与已知小鼠精子micro RNA表达谱的一致部分;然后通过micro RNA靶基因注释、信号通路研究等手段,进一步分析ERα通过micro RNA途径影响小鼠植入前胚发育的可能机制;采用细胞免疫荧光技术验证靶基因表达产物(Oct4和Sox2)的变化。结果:1、ERα在小鼠植入前胚中的核内定位首次出现于S期中期,于第一次有丝分裂期核内定位消失,重新出现于2-细胞胚早期(第一次有丝分裂的末期),并保持核内定位和胞质定位至2-细胞胚分裂期。p ERα-S118在小鼠1-细胞胚的早期可见细胞核表面的定位,并且在1-细胞胚和2-细胞胚有丝分裂前期和前中期出现核内定位增强,中期出现胞质表达水平升高,于后期迅速降低;p ERα-S118在2-细胞核内的定位首次出现于S期启动时。2、MPP处理对小鼠植入前胚发育具有显著的抑制作用,其阶段特异性影响与小鼠ZGA发生的时间一致。经21~27 h MPP处理,小鼠合子型基因e IF1A和Mu ERV-L m RNA表达下调;1-细胞胚雄原核H3K27me3表达水平降低。MPP处理对小鼠的1-细胞胚和2-细胞胚的S期进程都有显著的抑制作用。c-MYC和E2F1在小鼠2-细胞胚内的表达不受MPP处理的影响。3、Micro RNA芯片结果显示,表达上调的micro RNA数目(126个)多于表达下调的micro RNA(64个)。受MPP处理影响的37个精源性micro RNA显著参与“应激反应、大分子物质代谢、基因表达和转录后调控、基因表观遗传学调控、负反馈调控(大分子物质)代谢过程、抑制基因表达、抑制m RNA翻译”等多种分子功能。精源性micro RNA靶基因集在“DNA依赖性转录调控”中有显著的富集;而且其中的小规模合子型靶基因更显著地富集于多种生物学过程。以“Akt1–Foxo3–Stat3–ERα–Oct4”为主轴的调控网络参与了小鼠小规模合子型基因激活的DNA依赖转录调控。经MPP处理后,小鼠2-细胞胚OCT4表达水平升高,SOX2表达下调;经Akt抑制剂API-2处理后,p ERα-S118表达上调。结论:1.ERα可通过影响小鼠早期植入前胚的S期进程、精源性染色质的组蛋白甲基化修饰、精源性micro RNA表达等途径,参与小鼠小规模合子型基因的DNA依赖性转录。2.ERα在小鼠合子型基因激活中的作用机制还包括对干性维持关键基因Oct4和Sox2的调控。3.而且,ERα在小鼠合子型基因激活中的作用受到Akt的磷酸化激活调控,而ERα又可以通过mi R-125a-5p和mi R-125a-3p途径,影响Akt的功能,形成反馈调控网络。