研究背景动脉粥样硬化是心血管系统疾病中最常见的疾病,也是冠心病的病理基础。血管内膜的灶状纤维化,粥样斑块形成,致管壁变硬、管腔狭窄,并引起一系列继发性病变。血管平滑肌细胞作为血管壁的重要组成部分,在动脉粥样硬化的整个病理变化中都起了作用。氧化应激损伤是动脉粥样硬化形成的一个重要机制。而血管平滑肌细胞在氧化应激损伤状态下的病理性增殖等一系列继发改变,在动脉粥样硬化发展过程中起了重要作用,亦是形成支架内再狭窄的重要原因。因此抗炎抗氧化和抑制平滑肌细胞增殖是实现抗动脉粥样硬化及抑制支架内再狭窄的重要途径。阿托伐他汀作为治疗动脉粥样硬化的基础药物他汀类中的一种,现已有多项研究证实阿托伐他汀具有抗炎、抗氧化,抑制血管平滑肌细胞增殖的作用。以上这些作用也是阿托伐他汀抗动脉粥样硬化的重要机制之一。雷帕霉素做为一种免疫抑制剂,通过与相应免疫嗜素RMBP结合抑制细胞周期G0期和G1期,阻断G1进入S期而发挥作用,现普遍应用于药物洗脱支架中,以达到减少血管壁对损伤修复过程中血管平滑肌细胞及新生内膜的过度增生造成的再狭窄。另有文献指出,雷帕霉素抑制血管平滑肌细胞增殖的同时可能造成血管平滑肌细胞的失功能性,但目前对于该方面的研究较少,且存在着较多争议,特别是对氧化应激损伤血管平滑肌细胞的影响研究甚少。此外,雷帕霉素联用阿托伐他汀对血管平滑肌细胞增殖等的影响仍缺少文献支持。因此,本实验以氧化应激损伤状态下的大鼠血管平滑肌细胞作为模型,通过应用阿托伐他汀以及不同剂量的雷帕霉素干预氧化应激损伤状态下的大鼠血管平滑肌细胞,并运用现代分子生物学技术,探讨两种药物对氧化应激损伤状态下大鼠平滑肌细胞的影响。目的以大鼠主动脉分离后原代培养的血管平滑肌细胞为研究对象,在三丁基过氧化氢(t-BHP)刺激诱导下使其处于氧化应激损伤状态,运用现代分子生物学技术,如水溶性四唑盐(WST)-1法、水溶性四唑盐(WST)-8法、逆转录—聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)等,观察阿托伐他汀以及不同剂量的雷帕霉素对氧化应激损伤状态下大鼠平滑肌细胞的增殖、氧化损伤等的影响。旨在为两种药物在临床对动脉粥样硬化的治疗,以及对支架植入术后支架再狭窄的影响提供理论依据。方法取雄性wistar大鼠,体重180-200g,断头处死,无菌条件下取主动脉并剥去外膜和内膜,应用组织贴块法进行大鼠主动脉平滑肌细胞原代培养,细胞经α-平滑肌激动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SM-actin)抗体免疫组织化学鉴定,实验取用4-6代细胞。细胞毒性检测实验分组：1)正常对照组2) t-BHP(40μmol/L组)3) t-BHP(60μmol/L组)4) t-BHP(80μmol/L组)5) t-BHP(100μmol/L组)6) t-BHP(200μmol/L组)；放入孵育箱分别干预12h、24h、48h、72h,采用CCK8试剂盒,应用水溶性四唑盐(WST)-8法检测细胞存活率,目的是摸索t-BHP诱导主动脉平滑肌细胞氧化应激损伤模型的浓度及时间。最后确定干预浓度为60μmol/L,24小时。雷帕霉素及阿托伐他汀对氧化应激损伤状态大鼠血管平滑肌细胞增殖率的影响：实验分组：空白组、DMSO组、阿托伐他汀(3μmol/L)组(A3组)、雷帕霉素50nmol/L组(R50组)、雷帕霉素100nmol/L组(R100组)、联用组(阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L)。实验各组细胞给予相应药物干预2小时后,加入三丁基过氧化氢(t-BHP)刺激诱导氧化应激损伤24小时,采用CCK8试剂盒,应用水溶性四唑盐(WST)-8法检测细胞增殖率。雷帕霉素及阿托伐他汀对氧化应激损伤状态大鼠血管平滑肌细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力水平的影响：实验分组：空白组、DMSO组、阿托伐他汀(3μmol/L)组(A3组)、雷帕霉素50nmol/L组(R50组)、雷帕霉素100nmol/L组(R100组)、联用组(阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L)。实验各组细胞给予相应药物干预2小时后,加入三丁基过氧化氢(t-BHP)刺激诱导氧化应激损伤24小时,采用水溶性四唑盐(WST)-1法检测细胞内SOD活力水平。雷帕霉素及阿托伐他汀对氧化应激损伤状态大鼠血管平滑肌细胞内丙二醛(MDA)水平的影响：实验分组：空白组、DMSO组、阿托伐他汀(3μmol/L)组(A3组)、雷帕霉素50nmol/L组(R50组)、雷帕霉素100nmol/L组(R100组)、联用组(阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L)。实验各组细胞给予相应药物干预2小时后,加入三丁基过氧化氢(t-BHP)刺激诱导氧化应激损伤24小时,采用硫代巴比妥酸法,检测细胞内MDA水平。细胞衰老p-半乳糖糖苷酶(β-Gal)染色：实验分组：空白组、DMSO组、阿托伐他汀(3μmol/L)组(A3组)、雷帕霉素50nmol/L组(R50组)、雷帕霉素100nmol/L组(R100组)、联用组(阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L)。实验各组细胞给予相应药物干预2小时后,加入三丁基过氧化氢(t-BHP)刺激诱导氧化应激损伤24小时,采用由碧云天公司细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒,显微镜下观察细胞,计数蓝染的细胞为阳性细胞,每次随机挑选500个细胞,得到阳性细胞百分率,为衰老细胞的百分率。雷帕霉素及阿托伐他汀对氧化应激损伤状态大鼠血管平滑肌细胞内皮型NO合成酶(eNOS) mRNA表达的影响：实验分组：空白组、DMSO组、阿托伐他汀(3μmol/L)组(A3组)、雷帕霉素50nmol/L组(R50组)、雷帕霉素100nmol/L组(R100组)、联用组(阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L)。实验各组细胞给予相应药物干预2小时后,加入三丁基过氧化氢(t-BHP)刺激诱导氧化应激损伤24小时,总RNA采用Trizol试剂盒提取,实时荧光定量(RT-PCR)进行相对定量检测血管平滑肌细胞eNOS mRNA的表达量。雷帕霉素及阿托伐他汀对氧化应激损伤状态大鼠血管平滑肌细胞内皮型NO合成酶(eNOS)蛋白表达的影响：实验分组：空白组、DMSO组、阿托伐他汀(3μmol/L)组(A3组)、雷帕霉素50nmol/L组(R50组)、雷帕霉素100nmol/L组(R100组)、联用组(阿托伐他汀3μmol/L加雷帕霉素100nmol/L)。实验各组细胞给予相应药物干预2小时后,加入三丁基过氧化氢(t-BHP)刺激诱导氧化应激损伤24小时,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,取适当量蛋白,利用Western blot蛋白免疫印迹法测定血管平滑肌细胞中一氧化氮合成酶(eNOS)蛋白的表达情况。研究结果1、雷帕霉素及阿托伐他汀对氧化应激损伤状态大鼠血管平滑肌细胞增殖率的影响：统计结果表明,与空白组细胞增殖率(96.68±1.85%)相比,其余五组细胞增殖率均明显下降(P均小于0.01)。与DMSO组(76.97+5.48%)相比,四个药物干预组增殖率也明显下降,增殖率分别为单纯阿托伐他汀(A3)组(64.99±3.82%)、小剂量雷帕霉素(R50)组(62.27±7.10%)、大剂量雷帕霉素(R100)组(54.34±9.09%)和联合用药(R100+A3)组(38.09±6.07%),P均小于0.01。单纯阿托伐他汀和小剂量雷帕霉素组之间比较无统计学差异。而大剂量雷帕霉素组细胞增殖率低于A3组(P=0.005)和小剂量R50组(P=0.030)。联合用药组细胞增殖率较以上所有组均明显下降(P=0.000)。2、雷帕霉素及阿托伐他汀对氧化应激损伤状态大鼠血管平滑肌细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力水平的影响：6组细胞的SOD活力水平分别为：93.88±5.79(U/mgprot),92.08±12.05(U/mgprot),107.56±8.88(U/mgprot),109.91±13.31(U/mgprot),125.17±12.48(U/mgprot),140.53±8.42(U/mgprot)。统计结果表明,与空白组细胞相比较,DMSO组细胞SOD活力水平无明显差异。而其余4组药物干预组细胞SOD活力水平明显高于空白组和DMSO组(P均小于0.05)。单纯阿托伐他汀组和小剂量雷帕霉素组之间细胞SOD活力水平无明显差异。大剂量雷帕霉素组细胞SOD活力水平明显高于A3组(P=0.007)和小剂量R50组(P=0.013)。联合用药组细胞SOD活力则明显高于以上所有组(P<0.05)。3、雷帕霉素及阿托伐他汀对氧化应激损伤状态大鼠血管平滑肌细胞内丙二醛(MDA)水平的影响：6组细胞的MDA水平分别为：2.26±0.32(nmol/mgprot,2.04±0.19(nmol/mgprot),1.41±0.33(nmol/mgprot),1.35±0.35(nmol/mgprot),0.99±0.25(nmol/mgprot),0.62±0.21(nmol/mgprot)。统计结果表明,与空白组细胞相比较,DMSO组细胞的MDA水平无明显差异。而其余4组药物干预组细胞MDA水平与空白组和DMSO组相比则明显降低(P均小于0.05)。单纯阿托伐他汀组和小剂量雷帕霉素组之间细胞MDA水平无明显差异。大剂量雷帕霉素组其细胞MDA水平明显低于A3组和小剂量R50组(P均小于0.05)。联合用药组细胞MDA水平较以上所有组均明显降低(P<0.05)。4、各组细胞衰老β-半乳糖糖苷酶(SA-β-Gal)染色阳性率的比较6组细胞SA-β-Gal染色阳性率分别为：28.93±2.39%,26.11±3.15%,13.05±1.68%,12.29±1.28%,4.98±1.09%,2.38±0.83%。统计结果表明,与空白组细胞相比较,DMSO组SA-β-Gal染色率无明显差异。而其余4组药物干预组细胞SA-β-Gal染色率与空白组和DMSO组相比则明显降低(P均小于0.05)。单纯阿托伐他汀组和小剂量雷帕霉素组之间染色率无明显差异。大剂量雷帕霉素组细胞SA-β-Gal染色率明显则低于A3组和小剂量R50组(P均小于0.05)。联合用药组细胞SA-β-Gal染色率较以上所有组均明显降低。5、实验各组细胞eNOS mRNA和蛋白的表达通过多次采用RT-PCR和Western blot方法检测细胞eNOS mRNA和蛋白表达情况,结果发现eNOS无论基因水平还是蛋白水平在Wistar大鼠主动脉血管平滑肌细胞上均无表达。结论1)阿托伐他汀及雷帕霉素均能抑制氧化应激损伤状态下大鼠血管平滑肌细胞的增殖,两药联用的抑制作用大于两种药物单独应用。2)阿托伐他汀及雷帕霉素均能提高氧化应激损伤状态下大鼠血管平滑肌细胞的SOD活力水平,两药联用优于两药单独应用。3)阿托伐他汀及雷帕霉素均能降低氧化应激损伤状态下大鼠血管平滑肌细胞的MDA水平,两药联用优于两药单独应用。4)阿托伐他汀及雷帕霉素均能降低氧化应激损伤状态下大鼠血管平滑肌细胞的SA-β-Gal染色阳性率,两药联用优于两药单独应用。5)合成NO的内皮型NO合成酶(eNOS)在大鼠血管平滑肌细胞的基因水平及蛋白水平中均无表达。药物干预亦未能对该结果产生影响。提示两种药物减少大鼠血管平滑肌细胞的氧化应激损伤与NO合成酶(eNOS)之间并未存在明确关系。