Ca²⁺是生物体维持正常新陈代谢和行使生理功能的重要元素。Ca²⁺是细胞刺激-反应信号转导机制中的关键信号分子，在生物体响应外界生物的或非生物的胁迫中发挥重要作用。响应于各种各样的刺激（如光、重力、生物的和非生物的胁迫、激素），植物内Ca²⁺浓度通过增加Ca²⁺内流方式迅速提高，然后经由Ca²⁺外流过程使胞内游离Ca²⁺快速恢复到基础水平，这种过程产生钙信号。各式各样的细胞外刺激引起特异的Ca²⁺浓度升高，Ca²⁺直接的或通过Ca²⁺感应器间接的调节细胞中重要的酶和蛋白质，从而实现对生物体对环境的应激反应以及细胞正常的代谢、生长和分裂等活动的调控。 CaM是生物体内分布最广、最保守的Ca²⁺结合蛋白。CaM是一种酸性小分子蛋白，存在于所有已有研究的真核生物中。CaM作用机制的特征在于它能解码包含Ca²⁺信号的时空模式，从而引发代谢变化和基因表达。CaM通过直接与Ca²⁺相互作用的方式，将偶连的Ca²⁺信号转换为改变下游效应蛋白的活性，从而直接或间接的调控环境胁迫（如触摸和冷休克等）引起的生物体反应，以及细胞生长、分裂、运动、新陈代谢、受精，外界胁迫的应答反应等多种生理过程。作为Ca²⁺的保守受体蛋白，动物和植物中CaM的结构相似，因此Ca²⁺／CaM调控的信号可能也很相似。参照花粉管中Ca²⁺的分布特征，推测CaM也会有类似的顶端聚集的梯度分布。作为细胞内Ca²⁺的主要受体，CaM也参与了极性细胞的顶端生长过程。 花粉管是具极性组成细胞质的顶端生长细胞，在植物细胞研究中它们是一类具吸引力的研究模式。花粉的萌发和花粉管生长是一个复杂的动力学过程。作为研究植物细胞生长的模式系统，花粉管生长一直吸引着人们的注意。花粉落在可识别的柱头上，花粉内储存的RNA、蛋白质以及，生物活性小分子启动花粉迅速萌发，生长出的花粉管在花柱内生长，最后到达子房，将两个精细胞释放到胚囊中与卵细胞和中央细胞融合，发生双受精作用。花粉或花粉管细胞感知外部信号后通过信号转导级联反应控制萌发、调招花粉竹’卜长方向，这一系列动力学的细胞事件关系到受精的J戊败。花粉管生长受到细胞内环境的控制，以维持合适的离一子浓度、肌动蛋白、胞吐和胞吞的平衡来实现花粉管的顶端生长。这些过程中Ca2+的作川己经进行的大量研究表明，生长的花粉管顶端存在着指向花粉管顶端逐渐增加的Ca2+梯度。Ca2+在花粉管顶端的聚集伴随着花粉管的振荡生长，同!l寸花粉管顶区C了+的重新分布导致花粉管产生新的生长方向。花粉管生长过程中CaM的作用是植物有性生殖研究的焦点之4。CaM介甘的调竹方式J’一泛存在J几Ca2+通道家族，它通过调控离子运输的方式来控制ca2+的动态平衡，即调节ca2+浓度高一于或低一于某一数值从而花粉管生长能被有效的调控。然而，对J立caM—这种ca2+重要受体，在花粉萌发生长过程中的作用却研究较少。 研究CaM分布的方法主要有免疫细胞化学定位法、CaM拮抗剂标记法、mRNA原位杂交及荧光标记CaM或CaM mRNA、GFP一CaM融合蛋亡l定位CaM。我们通过ous或oFP标记eaM，从而在活体细胞内对CaM进行fr寸空观测不l一定位，;卜探讨细胞内CaM的分布特点和细胞功能的相关性。本文构建C“材和G石尸或G以犷的融合基因CaM⁶子’1〕不[I CaM一GUS，少仁分别置J二花椰菜花11卜病毒355启动子和花粉特异启动子LAT52一7控制下，通过农杆菌介导的转化法将植物转化载体转化到烟草 （Nieoliana tabaeum SRI）「}’之，我们主要采J月eFP为J反告基因，以转墓Ikl烟草花粉为研究材料，在激光共聚焦扫描系统（confoca曰ascr soanning systcm，cLsM）一卜追踪活体细胞内CaM的11寸“;可分布，从细胞学角度对CaM的生理功能进行研究。主要研究结果如一卜: 1.GUS染色结果以及CaM一GFP荧光检测结果显示，CaM厂一泛分布于植物根、茎、叶等组织，并在生长分裂旺盛、能敏锐感触外界刺激的组织细胞如根尖生长点细胞、根毛细胞、表皮毛细胞、气孔保卫细胞、维管束细胞的细胞质中含量较多。CaM在细胞内呈现出极性分布，主要集中在保卫细胞和表皮毛细胞的相邻两个细胞连接处细胞膜内侧。水合萌发的花粉和正在生长的花粉管中也观察到了CaM，在花粉萌发沟处检测到较高的浓度，少以上CaM在花粉管顶端呈现出梯度分布。研究结果表明，细胞内CaM的不均匀分布可能与细胞功能相关。 2.钙调素幕因和绿色荧光蛋白基因的融合墓因（cam一沙）置于花粉特异启动rLAT52一7调控下，;卜采J一IJ激光共聚焦士l描系统（e（）nfoeal laser seanning system，C比M）对CoM在花粉水合萌发过程f!，的分布进行实11」‘观察。高水，!之的CaM聚集在花粉粒的毛个li)’J发孔处，)卜在‘!二长的花粉管项区（距离顶端仆10卜‘m区域）l一11项端到华部的方向上CaM呈现出山强到弱的梯度分布。在花粉水合萌发过程‘}，，其中一个萌发孔积累了比其他两个萌发孔高得多浓度的olM。当花粉粒水合约90（）、时，分布f细胞质的CaM表现出极性运动，即从细胞质运动到后续时间中（约l37（）s）将长出花粉竹的萌发孔。然而，刚萌发出的花粉管（约2一3卜‘m长）?